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ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2019, 16(2), jul-dic.: 187-193.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
EFFECTS OF β-CARIOFYLENE OF PIPER NIGRUM EXTRACT IN THE
SPERM HYPERACTIVATION AND IN THE FERTILIZING CAPACITY OF
TETRAPYGUS NIGER (MOLINA, 1782) “BLACK SEA URCHIN”
EFECTOS DEL EXTRACTO DE β-CARIOFILENO DE PIPER NIGRUM EN LA
HIPERACTIVACIÓN ESPERMÁTICA Y EN LA CAPACIDAD FECUNDANTE
DE TETRAPYGUS NIGER (MOLINA, 1782) ‘‘ERIZO NEGRO DE MAR’’
Daniela Zapata1; Joyce Wixsan1; Katherine Hinostroza1; Santiago Justo1; Hugo Gonzales-Figueroa1
1 Laboratorio de Biotecnología Animal. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú.
2 Department of Biochemistry - Institute of Chemistry University of Sao Paulo, Brasil.
Author for correspondence: hgonzales@urp.edu.pe
ABSTRACT
We analyzed hyperactivation and fertilizing capacity of the sperm of Tetrapygus niger “black sea urchin” in the presence of
β-caryophyllene. β-caryophyllene obtained from extracts of Piper nigrum “black pepper” and synthetic β-caryophyllene
donated by the Biosciences Institute of the University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil, was used. Tetrapygus niger spermatozoa
pretreated with the extracts of synthetic β-caryophyllene (β-caryophyllene A) and β-Caryophyllene from black pepper
(β-caryophyllene B) were used to study the e ect of this molecule on sperm hyperactivity (mean velocity and percentages
of progressive and continuous movement) and the fertilizing capacity (percentage of fertilized ovules). e average values
of the sperm head area in the control and in the treatments with βcaryophyllene A and β-caryophyllene B were: 33.8;
32.33 and 33.59 um2, respectively, indicating the homogeneity in the sample and that this was not in uenced by the
sesquiterpene. In the presence of β-caryophyllene A and B, the average speed observed was decreased by approximately
30 and 20 um/s, respectively, with respect to the control. ere are signi cant di erences between the control and the
treatments with β-caryophyllene A and B, but not between the two treatments with β-caryophyllene. e progressive
movement of the sperm was also a ected. While all the sperm of the control group showed rapid progressivity; in the
treatment with β-caryophyllene B only 40% presented this characteristic and in the treatment with β-caryophyllene
A 100% were progressive slow. On the other hand, the β-caryophyllene B produced a slight decrease in fertilization
(96.76% of fertilized ovules) and in the presence of β-caryophyllene A, this was reduced to 79.50% with respect to the
control group. A possible mechanism to explain the e ects observed in this study would be the ability of β-caryophyllene
to activate inhibitory G proteins as reported in other studies.
Keywords: β−caryophyllene - fertilizing capacity - sperm hyperactivation
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v16i2.2529
Revista Biotempo
Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma
(FCB-URP)
ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión Electrónica: 2519-5697
Volumen 15 (2) Julio - Diciembre 2018
LIMA / PERÚ
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Zapata et al.
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RESUMEN
En el presente trabajo se analizó la hiperactivación espermática y la capacidad fecundante del espermatozoide de Tetrapygus
niger (Molina, 1782) “erizo negro de mar” en presencia de β-carioleno. Se utilizó el sesquiterpeno β-carioleno
obtenido a partir de extracto de Piper nigrum L. “pimienta negra” y de β-carioleno sintético donado por el Instituto de
Biociencias de la Universidad de Sao Paulo (Sao Paulo, Brasil). Espermatozoides de Tetrapygus niger pretratados con los
extractos de β-carioleno sintético (β-carioleno A) y β-carioleno de pimienta negra (β-carioleno B) fueron utilizados
para la hiperactividad espermática (velocidad media y porcentajes de movimiento progresivo y continuo) y la capacidad
fecundante (porcentaje de óvulos fecundados). Los valores promedios del área de la cabeza del espermatozoide en el
control y en los tratamientos con β-carioleno A y β-carioleno B fueron de: 33,8; 32,33 y 33,59 um2, respectivamente,
indicando la homogeneidad en la muestra y que esta no fue inuenciada por el sesquiterpeno. En presencia de β-carioleno
A y B se observó la disminución de la velocidad promedio en aproximadamente 30 y 20 um/s, respectivamente, con
respecto al control; existiendo diferencias signicativas entre el control y los tratamientos con β-carioleno A y B, pero
no entre los dos tratamientos con β-carioleno. El movimiento progresivo de los espermatozoides también fue afectado,
mientras la totalidad de los espermatozoides del grupo control presentaron progresividad rápida, en el tratamiento con
β-carioleno B solo el 40 % presentaron esta característica y en el tratamiento con β-carioleno A el 100 % fueron
progresivos lento. Por otro lado, el β-carioleno B produjo una ligera disminución de fecundación (96,76 % de óvulos
fecundados) y en presencia de β-carioleno A, esta se redujo a 79,50 % con respecto al grupo control. Un posible
mecanismo para explicar los efectos observados en este estudio sería la capacidad del β-carioleno para activar proteínas
G inhibitorias, como ha sido reportado en otros estudios.
Palabras clave: β carioleno - capacidad fecundante - hiperactivacion espermática
INTRODUCCIÓN
Los espermatozoides de erizo de mar son capaces
de fusionarse con el óvulo después de una serie de
modicaciones estructurales, funcionales y moleculares,
denominadas capacitación y reacción del acrosoma
(Bernabó et al., 2012). Además, adquieren motilidad
solo cuando entran en contacto con el agua de mar (Neil
& Vacquier, 2004) y para aumentar la tasa de éxito de
la fecundación, son atraídos por moléculas dispersadas
por los óvulos que en su cubierta gelatinosa contiene
péptidos activadores del espermatozoide (SAP) que se
unen a receptores especícos y promueven la quimiotaxis.
Cuando los espermatozoides se encuentran con el óvulo
ocurre la reacción del acrosoma y la polimerización
de la actina que conduce a la extensión del túbulo
acrosomal que permitirá la fusion de las membranas del
espermatozoide con la del óvulo (Kamei & Gable, 2003).
El sistema endocannabinoide es una vía de señalización
endógena que está ampliamente distribuída en los
vertebrados e invertebrados, el cual participa en
múltiples vías metabólicas regulando de forma versátil
la siología celular. Este sistema está constituido por los
receptores de cannabinoides, sus agonistas endógenos o
endocannabinoides, las enzimas responsables de la síntesis
y degradación de los mismos y las vías de señalización
intracelular reguladas por los endocannabinoides, así
como los sistemas de transporte (Lu & Mackie, 2016).
Los receptores cannabinoides CB1 y CB2 están acoplados
a la proteína G y se expresan en mamíferos, aves, reptiles
e invertebrados como equinodermos (McPartland et al.,
2006).
Existen evidencias que en la membrana plasmática
del espermatozoide de Strongylocentrotus purpuratus
(Stimpson, 1857) “erizo de mar” se localiza un receptor
cannabinoide que tiene como agonista una sustancia
proveniente de la capa gelatinosa del huevo o cigote, que
cuando es bloqueado por un cannabinoide psicoactivo de
Cannabis sativa, reduce la capacidad de fecundación del
espermatozoide (Chang et al., 1993). Asimismo, en estos
espermatozoides en presencia de tetrahidrocannabinol
(THC), cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN),
agonistas de los receptores cannabinoides CB1 y CB2,
se inhibe la reacción del acrosoma, impidiendo la
fecundación (Schuel et al., 1991).
El β-carioleno es un sesquiterpeno cannabinoide
que actúa como agonista natural selectivo del receptor
cannabinoide CB2 (Gertsch, 2008). Se encuentra en
grandes cantidades en los aceites esenciales de muchas
especias y plantas alimenticias, como Origanum vulgare
L. ¨orégano¨ (Mockute et al., 2001), Cinnamomum
Piper nigrum extract on Tetrapygus
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spp. ¨canela¨ (Jayaprakasha et al., 2003) y P. nigrum
L. ¨pimienta negra¨ (Orav et al., 2004) y es el mayor
componente en C. sativa.
Se ha reportado que el receptor cannabinoide CB2 pre-
sente en la supercie de la membrana plasmática de los
espermatozoides humanos regula la motilidad espermáti-
ca (Agirregoitia et al., 2010).
En el presente trabajo se analiza la hiperactivación
espermática y la capacidad fecundante del espermatozoide de
T. niger “erizo negro de mar” en presencia del sesquiterpeno
β-carioleno, de extracto de pimienta negra y sintético.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Obtención de β-carioleno de Piper nigrum y
β-carioleno sintético
La obtención de β-carioleno se realizó en el laboratorio
de Química de la Facultad de Ciencias Biológicas (FCB)
de la Universidad Ricardo Palma (URP), Lima, Perú. La
extracción de β-carioleno a partir de P. nigrum se realizó
siguiendo la metodología descrita por Zhou et al. (2012)
con algunas modicaciones. P. nigrum seca se maceró
durante una semana en metanol. Posteriormente, se
utilizaron dos etapas de cromatografìa en capa na para
puricar el β-carioleno. En la primera etapa se utilizó
como fase móvil una mezcla de cloroformo:metanol 9:1,
dejando correr la muestra hasta alcanzar 30 mm; luego,
en la segunda etapa se usó éter de petróleo:etil acetato
10:1, dejando correr la muestra hasta alcanzar 50 mm.
La presencia de β-carioleno se conrmó utilizando
revelador de vanilina en H2SO4 1 %. El β-carioleno fue
recuperado de la silica gel por raspado y posteriormente
extraído con éter etílico. Finalmente, el éter etílico se
evaporó en baño maría y el extracto nal obtenido fue
utilizado para el ensayo biológico.
El β-carioleno sintético fue donado por el Instituto de
Biociencias de la Universidad de Sao Paulo (Sao Paulo,
Brasil).
Colecta de especímenes de T. niger “erizo negro de mar”
Los especímenes de T. niger “erizo negro de mar” se
recolectaron en las rocas ubicadas en la orilla del muelle
de la playa Pescadores de Chorrillos (-12.164935,
-77.029915), Lima, Perú fueron colocados en agua de
mar a temperatura ambiente (14-16°C) e inmediatamente
transportados al Laboratorio de Biotecnología Animal de
la FCB, URP.
Obtención y preparación de los gametos
Los especímenes colectados se mantuvieron en un
recipiente provisto con un aireador y agua de mar, la cual
fue renovada continuamente. Los gametos se obtuvieron
por estimulación química, inyectando en la cavidad oral,
de cada espécimen, 1 mL de una solución de KCl 0,15
M.
Para la preparación del control, se diluyó 100 uL de
espermatozoides en 100 mL de agua de mar estéril y
se homogeneizó lentamente. Para el tratamiento con
β-carioleno sintético (β-carioleno A) se adicionó 10 uL
de este a 100 mL de agua de mar estéril, asumiendo una
pureza de 100 % se obtendría una concentración nal
de β-carioleno de 10 uM. Posteriormente se añadió a
la solución 100 uL de espermatozoides y se homogeneizó
lentamente. Se procedió del mismo modo para el
tratamiento con extracto de β-carioleno (β-carioleno
B). Los óvulos, previamente lavados, fueron diluidos en
100 mL de agua de mar estéril (Olaechea et al., 2006).
Fecundación in vitro
Para el ensayo de fecundación se agregó la dilución
control de espermatozoides a la dilución de óvulos, se
dejó reposar por 10 min, se homogeneizó la dilución y
se extrajo una gota para su observación en el microscopio
óptico. Se cuanticaron los óvulos fecundados y los no
fecundados en cada campo de 3 láminas preparadas.
Se repitió el procedimiento para las diluciones de
espermatozoides tratados con los extractos A y B de
β-carioleno (Olaechea et al., 2006).
Hiperactivación espermática
Para el análisis de la hiperactividad espermática se
utilizaron también los 3 tratamientos de espermatozoides
(control, tratamiento con β-carioleno A y tratamiento
con β-carioleno B), colocando una gota de la dilución
en una placa Petri para su posterior observación en un
microscopio invertido conectado a una cámara. Se
generaron videos e imágenes por cada tratamiento.
Análisis de datos
Las imágenes y videos obtenidos fueron procesados
utilizando el software ImageJ. Se calculó el tamaño y
velocidad promedio de los espermatozoides. Para los
análisis estadísticos se utilizó el software SPSS.
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Aspectos éticos
Los especímenes son animales de vida libre y no se
encuentran en peligro de extinción. Los autores señalan
que se cumplieron todos los aspectos éticos nacionales e
internacionales.
RESULTADOS
La supercie de la cabeza de los espermatozoides no fue
alterada en el medio control y con β-carioleno (Fig. 1).
Los valores promedios de 33,8 um2 en el medio control,
32,33 um2 en β-carioleno sintético (A) y 33,59 um2 en
el extracto de β-carioleno (B) respectivamente y el nivel
de signicancia p < 0.275 del análisis de varianza, indica
la homogeneidad en las muestras
Figura 1. Promedio del área de la cabeza de espermatozoides de Tetrapygus niger en el medio control y en los medios con
β-carioleno.
El movimiento asimétrico amplio y acelerado del agelo
de los espermatozoides del erizo negro de mar denominado
hiperactivación, disminuye en los medios que contienen
β-carioleno. En la gura 2, se puede observar que en el
medio con β-carioleno A la hiperactivación disminuye
drásticamente (aproximadamente 30 um/s menos con
respecto al control), mientras que en el medio con
β-carioleno B, la disminución fue del orden de 20 um/s
aproximadamente con respecto al control. Se comprobó
mediante el análisis de varianza (prueba de Kruskal Wallis)
que existe diferencia signicativa entre la hiperactivación
en el medio control y los tratamientos con β-carioleno
(p: 0,00 y 0,02 respectivamente) pero no entre los dos
tratamientos con β-carioleno (p: 0,10).
Figura 2. Valores promedios de la velocidad de hiperactivación de los espermatozoides de Tetrapygus niger en los diferentes
medios de incubación.
Piper nigrum extract on Tetrapygus
191
De la misma manera, el movimiento progresivo y continuo
también se alteró en los medios con β-carioleno (tabla 1).
Los espermatozoides que estuvieron en el medio control
presentaron progresividad rápida (A) en su totalidad,
Con respecto a la fecundación in vitro, esta disminuyó tras
el tratamiento de los espermatozoides con β-carioleno.
El porcentaje de fecundación con los espermatozoides del
medio control fue de 100 %; por otro lado, los óvulos
DISCUSIÓN
En este trabajo se presentan los resultados preliminares
de la capacidad fecundante del espermatozoide de T.
niger “erizo negro de mar” en presencia del sesquiterpeno
β-carioleno obtenido de P. nigrum “pimienta negra” o
sintético.
Los espermatozoides de T. niger no alteran su
organización estructural en presencia de los medios que
contienen β-carioleno, lo que es muy importante para
el inicio de los mecanismos que conducen a la capacidad
fecundante (Castellano-Torres et al., 2010). La cabeza,
dependiendo de la especie, puede medir entre 2 y 5
μm, contiene un núcleo haploide cuya cromatina está
altamente condensada y un acrosoma en la región apical
de la cabeza, el cual contiene enzimas hidrolíticas que
permiten al espermatozoide atravesar las cubiertas del
mientras que el tratamiento con β-carioleno B se redujo
a 40 %. El tratamiento con β-carioleno A presentó
espermatozoides sólo con movimiento progresivo lento.
fecundados con espermatozoides expuestos al extracto de
β-carioleno B llegaron a 96,76 %, mientras que en el
tratamiento con β-carioleno A la fecundación se redujo
a 79,50 % (tabla 2).
óvulo (Sardet & Tiney, 1970), el promedio del área de la
cabeza de T. niger fue de 33,8 um2.
Gertsch (2008) mostraron que el β-carioleno es
agonista selectivo del receptor de cannabinoide tipo 2
(CB2). El receptor CB2 activado se asocia a una proteína
G heterotrimérica inhibitoria (Gi/o) pero no a proteínas
G estimulantes (Gs) (Demuth & Molleman, 2006).
Cuando el receptor de membrana reconoce a su ligando
ocurre un cambio de GDP a GTP en la subunidad α, la
cual pierde anidad por las otras dos subunidades y se
libera del heterotrímero (Childers & Deadwyler, 1996).
La subunidad α ligada a GTP se liga a diversas proteínas,
incluyendo adenilciclasas. La unión de la subunidad alfa
de Gi/o a la adenilciclasa inhibe su actividad evitando
la formación de cAMP a partir de ATP (Milde et al.,
2013). Baja concentración intracelular de cAMP no
es capaz de activar la proteína quinasa A (PKA) la cual
Tabla 1. Porcentajes del movimiento progresivo y continuo de los espermatozoides de Tetrapygus niger en los diferentes
medios de incubación.
Medios de incubación
Porcentaje (%) de movimiento progresivo y
continuo
A* B** C***
Agua de mar (control) 100 0 0
β-carioleno A 0 100 0
β-carioleno B 40 60 0
A*: progresivo rápido: > 25 um/s; B**: progresivo lento: entre 5 um/s y 25 um/s y
C***: no progresivo: < 5 um/s.
Tabla 2. Porcentaje de óvulos fecundados por espermatozoides de Tetrapygus niger en los diferentes medios de
incubación.
Medios de incubación Porcentaje (%) de fecundación in vitro
Fecundados No fecundados
Agua de mar (control) 99,20 0,80
β-carioleno A 79,50 20,50
β-carioleno B 96,76 3,24
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en su forma activa estimula a las quinasas de tirosina
espermáticas que conducen una cascada de fosforilación
involucrada en la motilidad espermática (Visconti et
al., 1995). Estas armaciones podrían explicar que el
β-carioleno promueve la disminución de los valores de
hiperactivación en los espermatozoides de erizo negro de
mar signicativamente.
Por otro lado, las subunidades β/γ de proteínas G pueden
inhibir los canales de calcio mediante su ligamiento a estos
(De Waard et al., 1997). Los cannabinoides son capaces de
inhibir la abertura de los canales de calcio, probablemente a
través del mecanismo anteriormente mencionado (Chang
et al., 1993) alterando las concentraciones intracelulares
de calcio que evitarían la hiperactivación espermática,
la que requiere concentraciones en el rango de 100 –
300 nanomolar para que ocurra (Pereira et al., 2015).
Además, la entrada de calcio al citoplasma espermático es
importante para iniciar la reacción del acrosoma (Chang
et al., 1993) y se produzca la fecundación del óvulo. Estos
mecanismos podrían explicar el efecto en la fertilidad
observada tras el tratamiento con β-carioleno.
En conclusión, es posible que el β-carioleno, al igual
que otras sustancias cannabinoides, altere la motilidad
espermática y también bloquee la reacción del acrosoma.
Sin embargo, ya que no se realizó una medición del grado
de pureza del extracto de β-carioleno a partir de la
pimienta negra, no podemos descartar la posibilidad de
que otros compuestos hayan contribuido en la reducción
de la motilidad y los porcentajes de fecundación
observados. Ensayos con extractos con pureza vericada
deben ser realizados para conrmar las evidencias
observadas en este estudio.
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