image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-701Lab. Microbiología Ambiental y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas - Universidad Nacional Mayor de San Marcos.2Dpto. Química Orgánica, Facultad de Química e Ingeniería Química – Universidad Nacional Mayor de San MarcosBIODIVERSIDAD DE Bacillus thuringiensis patotipos II y IV y Bacillus sphaericusAISLADOS DE SUELOS AGRÍCOLAS PERUANOS1Abad Flores P.2Juan C. Woolcott H.(1Rosa M. Egusquiza C.1Alejandro Patiño G. 12Fred García A.RESUMENSe aislaron 18 cepas nativas de Bacillus thuringiensis y 3 cepas deBacillus sphaericus con potencial mosquitocida, de 175 muestras de aguas estancadas y suelos agrícolas de diferentes partes del país. Las observaciones microscópicas de colonias características, mostraron la presencia de cristales parasporales típicos de B thuringiensis. Los bioensayos rea-lizados mostraron a las cepas BT-UNMSM-112 y BT-UNMSM-118 como las de mayor capacidad entomocida frente a los primeros estadios de Anopheles pseudopunctipennis y B. sphaericus - Bs-UNMSM 107 mostró la mayor efectivi-dad frente a Culex spp. Se determinó los niveles de susceptibilidad, en el laboratorio, de esta especie a Bacillus thurin-giensisvar. Israelensisy Bacillus sphaericus, encontrándose una CL de 0.215 y 0.360 ìg/mL y CL0.236 y 0.428 5090 ìg/mL para B. thuringiensisBT-UNMSM 112 y BT-UNMSM 118 respectivamente y una CL de 0.87 ìg/mL y una 50CL de 0.95 ìg/mL para B. sphaericusBs-UNMSM 107 frente a An. pseudopunctipennis. Para Culex spp se encontró 90una CL de 0.562 y 0.920 ìg/mL y CL2.52 y 3.20 ìg/mL para B. thuringiensisBT-UNMSM 112 y BT-UNMSM 118 5090 respectivamente y una CL de 0.34 ìg/mL y una CL de 0.44 ìg/mL conB. sphaericusBs-UNMSM-107.5090Palabras claves: B. thuringiensis, B. sphaericus–Aislamiento y toxicidad para mosquitosSUMMARYIt was isolated 18 strains of Bacillus thuringiensis and 3 strains of B. sphaericus with entomocidal propertiesfrom175 samples of soil & wastewater Peruvian´s farms. The microscopics observations of these strains showed the crystal parasporal typical from B. thuringiensis. The bioassays performed showed us the strains BT-UNMSM-112 y BT-UNMSM-118 as the most promisorious as biolarvicides against first instars of A. pseudopunctipennis and B. sphaeri-cus-B-107 showed a high efficiency against Culex spp.It was determined susceptibility levels of Both mosquitoes against Bacillus thuringiensisvar. Israelensisand Bacillus sphaericus.It was found aLC de 0.215 and 0.360 ìg/mL 50and LC0.236 and 0.428 ìg/mL para B. thuringiensisBT-UNMSM 112 y BT-UNMSM 118 respectively and a LC of 90 500.87 ìg/mL and a LC of 0.95 ìg/mL to B. sphaericusBs-UNMSM 107 against An. pseudopunctipennis. It was found 90a LC of 0.562 and 0.920 ìg/mL and a LC2.2 and 3.20 ìg/mL against Culex spptoB. thuringiensisBT-UNMSM 112 5090 and BT-UNMSM 118 respectively and a LCof 0.34 ìg/mL and a LCof 0.44 ìg/mL withB. sphaericusBs-UNMSM-50 90 107.Key words: B. thuringiensis, B. sphaericusisolation & Mosquitocidal ToxicityDoris Huerta C.57
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70INTRODUCCIÓNpara una posterior identificación (Chilcott & Wigley 1993).Los mosquitos anofelinos y culicidos son vectores de muchas enfermedades metaxénicas: Malaria, Dengue, Identificación de Bacillus thuringiensis y B. sphaericusFiebre amarilla, entre otros, los cuales han sido contro-La identificación preliminar de las cepas aisladas se lados con insecticidas químicos con un éxito inicial en efectuó por observación en microscopia de contraste de su control, sin embargo, los insectos han desarrollado fases a 1000X que permitió confirmar la presencia de resistencia a los insecticidas sintéticos generando muchos problemas ambientales, destruyendo insectos cristales parasporales (
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image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70y semiesféricos. Las 3 cepas de B. sphaericuspresenta-en su mayoría a formas circulares de 6-8 mm de diá-ron esporas centrales y ovoides, cuerpos parasporales metro, aplanadas, opacas y de color blanco mate, bor-amorfos.des ondulados o rizoides.; morfológicamente corres-pondían a bacilos rectos, de extremos redondos o Las características morfológicas de colonias en Agar romos, Gram positivos, con esporas ovales subcentra-nutricio de las cepas de B. thuringiensisaisladas se les o terminales (Fig.2 y 3 Tabla Nº5).muestran en la Fig. 1, 1 A , tabla Nº 4, Correspondiendo TABLA 1. FRECUENCIA y DISTRIBUCION DE CEPAS NATIVAS de Bacillus thuringiensisy B. sphaericusCON POTENCIAL MOSQUITOCIDAEstación de muestreoMuestrasBacillusSp aisladosB. th. UFC/gaisladosB.sph.UFC/gaislados% de Bty B. sph/total de BacillusANCASHHuarazYungayCarhuaz1010101010101-13.6 X106-5.2 X106------0.39-0.39LAMBAYEQUE: ChiclayoLambayeque10101210113.1 X1071.2 X1071-3.6X107-0.780.39LORETO:Maynas102418.6X10711.8X1070.78UCAYALI102012.3X1070.39CUSCO: Urubamba112012.5 X106--0.39CAJAMARCA:91613.5 X106--0.39LIMA:HuaralCantaCañeteHuarochiri101061020241210111-3.8 X1077.2 X1066.8 X106---------0.390.390.39-JUNIN: HuancayoTarmaChanchamayo8651010131-12.6 X1063.2 X1063.2 X107------0.39-0.39AREQUIPA:CamanaCaillomaLa JoyaCaravelli6646344611-21.6 X1074.2 X1065.6 X1063.2 X106----------0.390.390.390.39MADRE DE DIOS88112.8 X1071.2X107--0.78Totales1752561831.177.0360
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70CRISTAL PROTEICO ESPORAFig.1 COLONIA DE B. sphaericusEN A. NUTRICIOFig. 1A. COLONIAS DE B. thuringiensisEN A.N.-LECITINAFig.2 B. th. COLORACIÓN GIEMSAFig.3 B. th. COLORACIÓN GRAMFig. 4 B. th. SOBRE AGAR PEMBAFig. 5 MICROFOTOGRAFIA DE B. thuringiensisPOR CONTRASTE DE FASES61
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70TABLA Nº2. DISTRIBUCIÓN DE CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensisy B. sphaericusPOR REGIÓN GEOGRÁFICA DE MUESTREOEstación deMuestreoClaveB.thuringiensisB. sphaericusTotal Bacillus spANCASH: HuarazCarhuazBT-UNMSMBT-UNMSM1011021010LAMBAYEQUE:ChiclayoLambayequeBT-UNMSMBT-UNMSM103105Bs-UNMSM-1041210LORETO:BT-UNMSM106Bs-UNMSM-10724UCAYALI:BT-UNMSMBs-UNMSM-10820CUSCO:UrubambaBT-UNMSM10920CAJAMARCA:BT-UNMSM11016LIMA: HuaralCantaCañeteBT-UNMSMBT-UNMSMBT-UNMSM111112113202412JUNIN: HuancayoChanchamayoBT-UNMSMBT-UNMSM1141151013AREQUIPA:CamanáCaillomaCaraveliBT-UNMSMBT-UNMSMBT-UNMSM116117118 Y 119344MADRE DE DIOSBT-UNMSMBT-UNMSM1201218TOTALES183256TABLA 3. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE COLONIAS DE B. thuringiensisy Bacillus sphaericusAISLADOS DE DIFERENTES ÁREAS GEOGRÁFICAS DEL PERUTIPO DE COLONIA DE B. thuringiensis y Bacillus sphaericusCepaFormaTamañoElevaciónColorBordeBT-UNMSM-121Circular4-7 mmAplanadaBlanco mateDentadaBT-UNMSM-102, 105Circular4-5 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-109, 114Circular4-5 mmAplanadaBlanco mateDentadaBT-UNMSM-103,117, 118Circular4-7 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-101, 110Circular4-6 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-106Circular8 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-111, 119Circular4-5 mmAplanadaBlanco mateEnteraBT-UNMSM-116, 120Circular6-7 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-112Circular5-6 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-115Circular5-5 mmAplanadaBlanco mateOnduladaBT-UNMSM-113Circular8 mmAplanadaBlanco mateEnteraBS-UNMSM-104, 107, 108Circular5 mmPlana convexaBlanco mateEntera62
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70TABLA 4. TIPOS DE CRISTALES DE CEPAS DE B. thuringiensis Y Bacillus sphaericusAISLADOS DE DIFERENTES TIPOS DE SUELOS DE ÁREAS GEOGRÁFICAS DEL PERÚCepa de B. thuringiensisy B. sphaericusTipo de sueloTipo de cristalPatotipoBT-UNMSM- 101, 102ArcillosoCuboideIIBT-UNMSM- 102, 103, 106, 109, 117Arcilloso, húmicoBipiramidalIVBT-UNMSM-106, 111, 112, 113, 120ArcillosoAmorfo semiesféricoIVBT-UNMSM-110, 118ArenosoSemiesférico cuboideIIBT-UNMSM- 105, 114, 119, 121 Arenoso, húmicoBipiramidalIVB. sphaericusBs-UNMSM-104, 107, 108Aguas estancadas--TABLA 5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MICROSCÓPICAS DE CEPAS DE B. thuringiensis y Bacillus sphaericus AISLADOS DE DIFERENTES ÁREAS GEOGRÁFICAS DEL PERÚColoraciónCepa de B.ThuringiensisGramAzul de CoomasieMorfologiaMicroscópicaPosición de laEsporaBT-UNMSM-102, 106, 113, 118,121++Bacilos con extremos romosSubterminalBT-UNMSM-101, 103, 109, 110, 114, 115, 120++Bacilos con extremos romosTerminalBT-UNMSM-105, 111, 112, 116, 117, 119++Bacilos con extremos circularesSubterminalBs-UNMSM- 104, 107, 108+-Bacilos cortos con extremos romosCentral yovóide63
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70Las características culturales y bioquímicas de las cripciones de Attathom T, Chongrattanameteekul cepas de B. thuringiensis, se muestran en las tablas Nº 6 (1995), y de Chatterjee, S. et al. (2007)y 7. Las características descritas concuerdan con las des-TABLA Nº 6. CARACTERÍSTICAS CULTURALES DE Bacillus thuringiensisy Bacillus sphaericusBacillus thuringiensisy B. sphaericusA.PEMBAC.N. NaCl 1%C.N. NaCl 5%C.N. NaCl 8%CatalasaLecitinasaManitolGluBT-UNMSM 101, 102, 105, 106, 109,110, 112,121 +++-++-+BT-UNMSM-103, 111, 116 ++--++-+BT-UNMSM- 113, 114, 115, 117, 118,119, 120 +++-++-+B. sphaericusBs-UNMSM-104, 107, 108+++-++-+TABLA Nº 7. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE CEPAS DE B. thuringiensis y Bacillus sphaericus AISLADOS DE DIFERENTES ÁREAS GEOGRÁFICAS DEL PERÚ.Características BioquímicasCepas de B. th. y B. sph.HidrólisisGelatinaHidrólisiscaseínaArgininaDHIndolV-PRxNO3UreasaBT-UNMSM-101, 120++--+++BT-UNMSM-102, 117++--++-BT-UNMSM-103, 105, 106, 109,116, 111+++-++-BT-UNMSM-112, 113114++--+++BT-UNMSM-115, 116+++-+++BT-UNMSM-118, 119 ++++++-BT-UNMSM-121+++++++Bs-UNMSM-104, 107, 10864++-+-++
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70El perfil de proteínas Cry en SDS-PAGE (Fig. 6) de las tienen componentes proteicos múltiples con pesos mole-cepas entomotóxicas examinadas fue similar al de la culares de 20 a 140 kDa. Los perfiles proteicos de las cepa referencial del serotipo B. thuringiensisvar. Israe-cepas que tenían cristales bipiramidales y cuboidales lensis.El perfil muestra que las cepas examinadas con-eran idénticosFig. 6. PERFIL DE PROTEINAS CRY ELECTROFORESIS SDS-PAGE1.B,th HD 2.Bt-UNMSM-1013.Bt-UNMSM-102 4.Bt-UNMSM-1035.Bt-UNMSM-105 6.Bt-UNMSM-1067.Bt-UNMSM-1098.Bt-UNMSM-1129.Bt-UNMSM-11310.Bt-UNMSM-114 11.Bt-UNMSM-11512.Bt-UNMSM-118B. th. Israelensis HD-968B. sphaericus NRRL-23268EstadioEstadioConcentraciónppplarvas/replicaI II III IV% mortalidad% mortalidad0.1254434153223100.5251210101244108810360.125161412125412121012460.2525212220218420211817760.525252224259624212125911.0252525252510025252525100Control250000000000Tiempo de observación: 72 Hrs.Concentración letalCL50 0.865 0.94720CL90 0.72450.88020TABLA Nº 8. DETERMINACIÓN PRELIMINAR DE LA MORTALIDAD DE LARVAS DE Anopheles pseudopunctipennisEXPUESTAS A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE B. thuringiensis Israelensis HD-968yB. sphaericus NRRL-2326865I II III IV
image/svg+xml66Biotempo 2010, Volumen 10, 57-70ESPECIES DE MOSQUITOSAnopheles pseudopunctipennisCulex sppCEPAS24 hr48 hrs24 hrs48 hrsB. th.IsraelensisHD-9680.1750.1341.921.78BT-10126.1024.3452.9250.78BT-1025.755.2515.8214.14BT-10310.129.8032.1228.38BT-10519.1518.1452.9050.78BT-10630.1426.2245.7244.52BT-10934.1530.4435.1231.78BT-11035.5531.1348.3644.50BT-11155.5250.9468.1264.02BT-1120.2450.2420.5620.488BT-11328.4628.0445.7444.88BT-11420.7420.1336.4233.12BT-11535.5032.3451.2248.44BT-11620.1820.3335.5035.08BT-11740.5438.6642.9040.78BT-1180.360.280.920.88BT-11965.4660.7478.2271.68BT-12048.7544.6261.4259.38BT-12134.4533.4151.7251.08B. sphaericus-232680.520.400.160.18B.s -1041.221.100.480.40B.s -1070.870.780.340.32B.s -1080.920.810.500.48TABLA Nº 9 . BIOENSAYOS DE TOXICIDAD DE B. thuringiensis var. IsraelensisY B. sphaericusnativos FRENTE A Anopheles pseudopunctipennisy Culex spp (CL ìg/mL)50
image/svg+xmlTABLA Nº 10. BIOENSAYOS DE TOXICIDAD DE B. thuringiensis var. israelensisy B. sphaericusnativos frente a Anopheles pseudopunctipennisy Culex spp (CL ìg/mL)90ESPECIES DE MOSQUITOSAnopheles pseudopunctipennisCulex sppCEPAS24 hrs48 hrs24 hrs48 hrsB. th. IsraelensisHD-9680.2150.2341.652.48BT- 10128.8026.3562.9260.78BT-1027.857.2524.7222.14BT-10312.7210.8036.7232.48BT-10520.7520.1562.6058.75BT-10636.4532.7265.1262.72BT-10954.1550.4475.1271.78BT-11045.6541.3838.3634.50BT-11165.5260.9478.1274.02BT-1120.2360.3402.522.68BT-11338.4632.0435.1235.18BT-11430.1430.1038.4233.12BT-11545.5042.7461.1858.45BT-11630.5830.3845.5042.08BT-11745.5447.6652.9050.18BT-1180.4280.3863.203.105BT-11975.4670.7488.2281.68BT-12058.7554.6268.5262.38BT-12144.4843.4159.7252.08B. sphaericus-232680.650.600.210.20B.s -1041.221.100.480.40B.s -1070.950.880.440.42B.s -1081.121. 080.600.5867Biotempo 2010, Volumen 10, 57-70
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70TABLA 11. DETERMINACIÓN DE LA MORTALIDAD DE LARVAS DE Anopheles pseudopunctipennisEXPUESTAS A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE B. thuringiensis israelensis y B. sphaerieusB. th. BT-UNMSM-112B. sphaericus B-UNMSM- 107EstadioEstadioConcentrationp.p.mNº larvas/replicaI II III IV% mortalidad% mortalidad0.125443412222280.5251210101242108810360.125161412125412121012460.2525212220218420211817760.525252224259624212125911.0252525252510025252525100Control250000000000Tiempo de observación: 72 Hrs.Concentración letalCL50 0.225 0.87CL90 0.2360.9568
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70Los bioensayos preliminares y los específicos se mues-Más de 380 cepas de B. sphaericusque son tóxicos a lar-tran en la tabla Nº 9, 10 y 11. Los bioensayos prelimina-vas de mosquitos de Culex, Aedesy Anopheles, forman res mostraron que la cepa B. thuringiensisBT- parte de la colección de la WHO y del Centro de Baci-UNMSM 112 tipo israelensis: fue tóxica para Anophe-llus entomopatógenos del Instituto Pasteur, París-les pseudopunctipennisy la cepaB. sphaericus Bs-Francia. (Baumann, P.1991; Clare, M. 2007).UNMSM-108 mostró una toxicidad alta para Culex spp Los bioensayos realizados mostraron a las cepas BT-La descripción de colonias, morfología microscópica y UNMSM-112 y BT-UNMSM-118 como las de mayor cristales enmascarados reportados en el presente traba-capacidad entomocida frente a los primeros estadios de jo, concuerda con las observaciones de Attathom T. et. Anopheles pseudopunctipennis y Bs-UNMSM-107 al 1995; Rampersad J; & Ammons D. 2005; Chatterjee, mostró la mayor efectividad frente a Culex spp. S. 2007.Se determinó los niveles de susceptibilidad, en el labo-Los bioensayos preliminares muestran que la cepa BT-ratorio, de esta especie a Bacillus thuringiensisvar. UNMSM-112 y BT-UNMSM-118 presentaron el Israelensisy Bacillus sphaericus, encontrándose una mayor grado de entomotoxicidad en relación a las cepas CL de 0.245 y 0.360 ìg/mL y CL0.236 y 0.428 referenciales de Bacillus thuringiensisvar. Israelensis5090 NRRL-HD 968 y B. sphaericus NRRL 23268.ìg/mL para B. thuringiensisBT-UNMSM 112 y BT-Los resultados de mortalidad se sometieron a un análi-UNMSM 118 respectivamente y una CL de 0.87 50sis de regresión log-Probit método de máxima verosi-ìg/mL y una CL de 0.95 ìg/mL para B. sphaericusBs-90militud para establecer la línea dosis-mortalidad y las UNMSM 107 frente a An. pseudopunctipennis. Para diferentes CL. Culex spp se encontró una CL de 0.562-0.920 ìg/mL y 50CL2.52-3.20 ìg/mL para B. thuringiensisBT-90 Las cepas nativas de B. thuringiensisBT-UNMSM 118, UNMSM-112 y BT-UNMSM-118 respectivamente y BT-112, mostraron una mayor actividad larvicida frente una CL de 0.34 ìg/mL y una CL de 0.44 ìg/mL con5090a Ann. pseudopunctipenniscomparado con la cepa refe-B. sphaericusBs-UNMSM-107.rencial y nativas de B. sphaericus, que mostraron mejor actividad entomocida frente a larvas de Culex spp. que coincide en gran medida con las observaciones de DISCUSIÓNRodríguez I B; et. al (1998), Rojas, J. E; et.al, 2001 y Mulligan 1980).No se ha reportado previamente en el Perú, ningún tra-bajo relacionado con el aislamiento y caracterización de Bacillus thuringiensis, y Bacillus sphaericusnati-LITERATURA CITADAvos con potencial mosquitocida, por lo que nuestro tra-bajo representa la primera contribución de la biodiver-ATTATHOM T, CHONGRATTANAMETEEKUL sidad de B. thuringiensisen suelos agrícolas naciona-W, CHANPAISANG J, SIRIYAN R (1995). les B. thuringiensis ha sido aislado del suelo, filosfera, Morphological diversity and toxicity of delta-insectos muertos, productos almacenados, excreta de endotoxin produced by various strains of Bacillus animales vegetarianos etc. y aprox. 30-100% bacte-thuringiensis. Bull. Entomol. Res. 85:167-173. rias esporuladas de la filosfera se hallaron que corres-BAUMANN, P., CLARK, M.A, BAUMANN, L &. pondía a B. thuringiensis (De Barjac H 1978; Martin ANDREW H(1991). Bacillus sphaericusas a Mos-& Travers, 1989, Johnson C. & Bishop A.H, 1996; quito Pathogen: Properties of the Organism and Its Bernhard K, et. al., 1997; Toxins. Microbiological Reviews, Sept. 1991, p. ).B. Bacillus sphaericus hasido aislado del sue-425-436 lo, aguas estancadas e insectos muertos (Massie, J., BERNHARD K, JARRETT P, MEADOWS M, 1985; Thiery I, Barjac H, 1989; De Barjac H. 1990; BUTT J, ELLIS DJ, ROBERTS G.M, PAULI S, Baumann, P, 1991; Ribeiro Vilarinhos P. et. al.1996; RODGERS P, BURGES H.G. ( 1997). Natural iso-Smith & Singer S., 2004; Clare M. et. al. 2007; Park, lates of Bacillus thuringiensis: World wide distri-C. M. 2007)bution, Characterization, and Activity against Insect Pests. J Invertebr Pathol.70: 59–68.Bacillus sphaericuses una bacteria bacilar Gram +. BRAVO A, SARABIA S, LOPEZ L, CERON, J., L. Aeróbico con esporas redondas comúnmente encontra-COVARRUBIAS, R. QUINTERO, A. ORTIZ, das en ecosistemas acuáticos y en suelo. Se han encon-M. ORTIZ, E. ARANDA ET AL.(1994). PCR trado cepas tóxicas a mosquitos en muchas partes del analysis of the cryIinsecticidal crystal family genes mundo, la cepa B. sphSSII-1 en la India, B. sph. 1593 de from Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Micro-Indonesia; 2362 de Nigeria, 2297 de Sri Lanka y IAB59 biol. 60:353-356 de Ghana (Baumann, P. et.al. 1991). CLARE M.; PARK, H.W., ZHONG, H.M. HAYES. S.R. (2007). Isolation of Bacillus sphaericuswith Roberts G. M, 1997;Ferré J. 1999;69
image/svg+xmlBiotempo 2010, Volumen 10, 57-70improved efficacy against culex quinquefasciatusMULLIGAN F., SCHAEFER C., WILDER W.J. Am. Mosquito Control Ass. Vol, 23 (4): 478-480.(1980). Efficacy and persistence of B. sphaericus CHATTERJEE, S. N.1, BHATTACHARYA, T.2, and B. thuringiensis H-14 against mosquitos under DANGAR, T. K.3 AND CHANDRA, G. (2007). laboratory and field conditions. J Econ. Entomol. Ecology and diversity of Bacillus thuringiensis in 73: 648-688.soil environment. African Journal of Biotechno-PARK, C. M, HYUN-WOO, HE ZHONG, logy Vol. 6 (13), pp. 1587-1591, 4 July 2007MANGUM, HAYES. S.R. (2007). Isolation of CHILCOTT, C. N.; WIGLEY, P. J.(1993). Technical Bacillus sphaericuswith improved efficacy against note: an improved method for differential staining culex quinquefasciatus. J. Am. Mosquito Control of Bacillus thuringiensis crystals. Letters in Ass. 23 (4) pp 478-480Applied Microbiology7: 67-70. PRIEST F. G. (1992). Biological control of mosqui-COVA GARCIA, P AND E, SUTIL. (1975). Clave pra toes and other biting flies by B. sphaericus and B. larvas de anofelinos de Venezuela. Bol. Direcc. thuringiensis. J. Appl. Bacteriol. 72: 357-369.Malariol. Saneam. Amnient. 15 : 6-24.RAMPERSAD J; AMMONS D. (2005): A Bacillus DE BARJAC H (1978). Un nouveau candidat a la thuringiensis isolation method utilizing a novel lutte biologique contre les moustiques: Bacillus stain, low selection and high throughput produced thuringiensis var israelensis. Entomophaga 23 atypical results BMC Microbiol. 5: 52(4): 309- 319.RIBEIRO VILARINHOS P, MARUNIAK J. E, DE BARJAC H.(1990). Classification of Bacillus HALL, D. W (1996). Characterization and Biolo-sphaericus strains and comparative toxicity to mos-gical Activity of a Brazilian Isolate of Bacillus quito larvae p. 228-236 In H. Barjac, D J Sutherland sphaericus (Neide) Highly Toxic to Mosquito Lar-(eds): Bacterial Control of mosquitoes & Black vae. Mem. Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. flies: Biochemistry, Genetics & Applications of 91 (6): 771-776 Bacillus thuringiensis israelensisand Bacillus sphaericusRutgers University Press, New Bruns-wickDULMAGE H.T.; CORREA J.A. Y MARTÍNEZ, A.J. 1970. Copricipitation wih lactose a means of recovering, the spore crystal complex of B. thurin-RODRIGUEZ I B., TAIDE W.P., DIAS J.M. (1998). giensis. J. Invert. Pathol. 15: 15-20. Studies on the Bacillus sphaericus larvicidal acti-FAST PG (1972): The delta endotoxin of Bacillus thu-vity against malarial vector species in Amazonia. ringiensis III: a rapid method for separating paras-Mem. Inst. Oswaldo Cruz 93 (4): 441-444.poral bodies from spores. J. Inv. Pathology 20:189-ROJAS, J. E; MAZZARRI, M.; SOJO, M; 140 YSRAEL GARCÍA G.(2001). Evaluación de la efectividad de Bacillus sphaericus cepa 2362 sobre Bacillus thuringiensislarvas de Anopheles nuñeztovari.Mérida, Venezue-la. Invest. Clín. Ven. 42 (2) FINEY D.J (1981). Probit Análisis, 3 ed edition, S. RUBIO-PALIS Y., CURTIS C.F. (1992) Evaluation Chand & Company limited Ltd, Ram Nagar, New of differents methods catching anopheline mosqui-Delhi, 333 pp.toes in western Venezuela. J. Amer. Mosquitoes MASSIE, J.; GRAHAM R. G,: WHITE, P.J. (1985) Contr. Assoc., 8: 261-267.Selective Isolation of Bacillus sphaericusfrom Soil SMIRNOFF W.A. (1962). A staining method for dif-by Use of Acetate as the Only Major Source of Car-ferentiating spores, crystal and cell of Bacillus bon. Applied & Environmental Microbiology, Vol. thuringiensis (berliner). Journal of Insect Patho-49, (6): 1478-1481 logy 4: 384-386.HOLT JG (1984). Bergey's manual of systematic bac-SMITH, R.A.; SINGER, S. (2004). teriology, Vol. I and II. Williams Wilkins, Baltimo-Biotechnology and re, USA, 1&2: 965-1599. Bioengineering Vol. 22 (7): 1335 -1355JOHNSON C, BISHOP AH. (1996): A technique for THIERY I, BARJAC H (1989). Selection of the most the effective enrichment and isolation of Bacillus potent Bacillus sphaericusstrains based on acti-thuringiensis. FEMS Microbiology Letters; vity ratios determined on three mosquito species 142:173–177. Appl. Microb. Biotechn. 31: 577-581 MARTIN P. A. W, TRAVERS R. S(1989). Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensisisolates. Appl. Environ. Microbial., 55:2437-2442.ROBERTS G.M., PAULI S., P. ROGERS & H.D. BURGES.(1997). Natural isolates of Bacillus thuringiensisworldwide distribution, characteri-zation and activity against insect pest. J. Invertebr. Pathol. 70: 59-68FERRÉ J. 1999. Distribution of cry1, cryII and cryV genes within isolates from Spain. Syst. Appl. Microbiol. 22:1?79-185Bacillus sphaericusfor the control of mosquitoes. 70
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