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Biotempo 2008, Volumen 8,
CAPACIDAD FECUNDANTE DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMARIOS DE
Cavia porcellus "cuy" MANTENIDOS EN ESTRES HIPOTERMICO
Hugo Gonzales Figueroa1
Hugo Mauricio Gonzales Molfino1
RESUMEN
Durante el estrés hipotérmico los espermatozoides de cuy conservan sus patrones de capacitación espermática,
hiperactivación, reacción del acrosoma y fecundación in vitro El piruvato, componente del medio de cultivo San
Marcos (SM), sería la fuente energética preferencial para mantener la supervivencia espermática en estrés
hipotérmico prolongado, a lo mejor, regulando el metabolismo oxidativo en el espermatozoide. De la misma
manera se constituiría en el sustrato ideal de la piruvato deshidrogenasa para iniciar la capacitación e hiperactivación
cuando los espermatozoides son incubados a 37°C. El imidazol provoca reacción acrosómica espontánea en los
espermatozoides hiperactivos y permite que estos puedan interaccionar con ovocitos maduros, fecundarlos e
iniciar el desarrollo embrionario temprano hasta blastocisto. La madurez ovocitaria se consiguió cultivando
Complejos Ovocito-Cumulo (COCs) en el medio North Carolina State University 23 (NCSU-23), usado por
primera vez para cuy.
En este trabajo se demuestra que la hipotermia prolongada a 5°C en un medio químicamente definido, SM, no
afecta los procesos espermáticos fundamentales para la adquisición de la capacidad fértil del espermatozoide de
cuy.
Palabras claves: Estrés hipotérmico, hiperactivación, reacción del acrosoma. blastocisto
SUMMARY
During hypothermic stress, guinea pig sperm retain their of sperm capacitation, hiperactivation, acrosome
reaction and in vitro fertilization patterns. The pyruvate, a component of San Marcos (SM) culture medium,
would be the preferred energy source to keep the sperm survival prolonged stress hypothermic, perhaps by
regulating the oxidative metabolism in the spermatozoon. In the same way would constitute the ideal substrate
for the pyruvate dehydrogenase regulates to sperm capacitation and hiperactivation when sperm are incubated
at 37 ° C. The imidazole causes spontaneous acrosome reaction in the hyperactived sperm and allows them to
interact with mature oocytes, fertilized and begin start early embryonic development to blastocyst.
Mature oocyte was achieved by cultivating Cumulus-Oocyte complexes (COCs) in the North Carolina State
University 23 (NCSU-23), used for the first time in guinea pig.
In this work demonstrates that the prolonged hypothermia at 5 ° C in a chemically defined, medium SM, does not
affect sperm fundamental processes for the acquisition of the capacity of fertile sperm of guinea pig.
Key words: Hypothermic stress, hiperactivation, acrosome reaction, blastocyst.
1 Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Animal, Instituto de Genética y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas.
Universidad Ricardo Palma.
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INTRODUCCIÓN
El espermatozoide de mamífero para fusionarse con
el ovocito necesita de cambios morfológicos y
fisiológicos conocidos como capacitación,
hiperactivación y reacción del acrosoma.
La capacitación in vivo, tiene lugar en el tracto genital
de la hembra y se acepta que es la fase o las fases
que promueve alteraciones en los patrones de
motilidad «hiperactivación» (Yanagimachi, 1988;
Frasser, 1977) y precede a la reacción del acrosoma
(Bedford, 1970). Está comprobado que no todas las
células de una población espermática inician la
reacción del acrosoma después de una inducción, esta
sólo ocurre en los espermatozoides hiperactivos
(Yanagimachi, 1994).
La capacitación espermática, la hiperactivación y la
reacción del acrosoma pueden lograrse in vitro
utilizando medios de cultivo adecuados, químicamente
definidos o semidefinidos. Un sistema de cultivo puede
denominarse «medio químicamente definido» cuando
en su composición sólo se encuentra sustancias
químicamente puras sin fluidos biológicos y además
contener algún producto biológico purificado como
albúmina sérica de bovino (Biggers et al. 1971). Sin
embargo algunas veces es necesario agregar fluidos
biológicos para estudiar la sensibilidad y los
requerimientos necesarios para los complejos
mecanismos que ocurren desde la fecundación hasta
el desarrollo embrionario temprano en mamíferos,
denominándose, entonces, sistemas de cultivo semi-
definidos (Van Thuan et al.. 2002).
La capacitación y reacción del acrosoma pueden
lograrse en medios químicamente definidos (Jaiswal
et al., 1998). Al respecto, se han encontrado
espermatozoides de cuy hiperactivos en el medio San
Marcos (SM) que contiene 22,3 mM de piruvato de
sodio (Gonzales-Figueroa, 1988).
Las hembras de los mamíferos tienen ovarios
bifuncionales que cumplen una función exocrina
cuando liberan ovocitos y una endocrina cuando
producen: estrógenos, progesterona, inhibina y
activina. El crecimiento folicular tiene un control
intraovárico y otro gonadotrófico, regulados por
señales paracrinas y endocrinas (Manikkan et al..
2002). Los ovocitos y las células foliculares forman
una unidad estructural y funcional denominada
complejo cúmulo-ovocito (COC).
El estrés hipotérmico, consiste en colocar caudas de
epidídimos de cuy sumergidas en el medio SM a
temperaturas entre 4-6°C por varios días (Gonzales-
Figueroa, 1988).
Se ha reportando que el uso de sistemas de cultivo
definidos in vitro, permiten un mejor esclarecimiento
de los mecanismos moleculares que promueven o
inhiben el desarrollo embrionario. Sustancias como
aminoácidos, sustratos energéticos, citrato y vitaminas
pueden tener una influencia decisiva en el desarrollo
embrionario (Keskintepe & Brackett, 1996).
En el presente trabajo se relaciona la permanencia
prolongada de espermatozoides epididimarios de cuy
en estrés hipotérmico con la capacitación espermática,
reacción del acrosoma y fecundación in vitro en el
medio San Marcos (SM).
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta del material biológico
Las caudas de epidídimo y los ovarios de cuy fueron
obtenidos de animales sacrificados para el consumo
humano en el mercado mayorista de Lima.
Supervivencia espermática en cauda de
epidídimos mantenidas en estrés hipotérmico
Las caudas de epidídimo seleccionadas fueron
colocadas en tubos de polipropileno que contenían 30
ml de medio SM, cubriéndose la superficie del tubo
con una capa de aceite mineral. Cada tubo contenía
4 caudas, que se mantuvieron entre 4 a 6°C, siendo
el medio renovado cada 48 horas.
Para verificar la supervivencia de los espermatozoides
se extraía en tiempos diferentes de estrés hipotérmico
una cauda. Con una tijera de punta fina se disectaba
la parte distal de la cauda que era colocada en 200 ul
de medio SM en un disco de cultivo Falcon. Con la
ayuda de pinzas de punta fina era trozada para facilitar
la salida de los espermatozoides, formándose una
«suspensión patrón». El movimiento masal de los
espermatozoides en la «suspensión patrón» observado
a través de un microscopio estereoscópico, nos
indicaba la supervivencia espermática.
Capacitación espermática
A partir de la «suspensión patrón» se hacía una
dilución cuya concentración final tenía 105
espermatozoides/µl. Se prepararon microgotas de 100
µl de medio SM cubiertas de aceite mineral. Estas
eran temperadas a 37º C entre 15 a 20 minutos antes
de agregarle 10 µl de la dilución espermática, para
luego ser incubadas a 37º C entre1 a 2 horas. Al
término del periodo de incubación se contaba, a través
de un microscopio compuesto de campo claro, 100
espermatozoides libres, determinándose el número de
espermatozoides hiperactivos que tenían movimientos
rápidos y el batimiento del flagelo asincrónico.
Evaluación de la reacción del acrosoma
Al término de 60 minutos de incubación, se agregó a
la microgota, que contenía espermatozoides
hiperactivos, 10 µl de una solución de imidazol (5mM),
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para incubarse nuevamente. Entre los 15 y 30 minutos
de incubación, se evalúo el número de
espermatozoides reaccionados. Sólo en los
espermatozoides recién obtenidos (control) la
reacción del acrosoma se logró después de 2 horas
de capacitación.
Recuperación y selección de ovocitos
Se utilizaron ovarios de hembras de cuy de los cuales
se recuperaron los complejos cúmulo-ovocito
(COCs) mediante el método de cortes transversales.
Utilizando una jeringa hipodérmica de 10 ml y una
aguja de 21G se aspiró los folículos que tenían entre
4 - 6 mm de diámetro, los que fueron colocados en
un tubo de polipropileno (50 ml) mantenido a una
temperatura de 37º C en baño María. Luego de 10
minutos de reposo, se extrajo el sedimento del fondo
del tubo llevándolo a una placa Petri, a la que se le
agregó 25 mM Hepes-buffer TCM-199 (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA) . Para la selección
de los COCs se tomaron en cuenta indicadores
morfológicos del cúmulo: número de capas,
compactación y transparencia, y del citoplasma del
ovocito, el color (densidad) y el tamaño de los
gránulos.
Maduración in vitro de los COCs
Como medio de maduración se utilizó el (NCSU-23;
North Carolina State University 23) (Petters y Wells,
1993) suplementado con 0.57 mM de cisteína, 10%
fluido folicular porcino, 10 IU/ml de gonadotropina
corionica equina, 10 IU/ml de gonadotropina coriónica
humana y 50 µg/ml sulfato de gentamicina (Sigma)
las que fueron colocadas en placas cubiertas con
aceite mineral e incubadas por 12 - 14 horas a 39ºC
con 5% CO2, 90% humedad. Transcurrido este
tiempo, los ovocitos se colocaron en el mismo medio
libre de hormonas por un periodo adicional de 10-12
horas.
Al término del cultivo de maduración, las células del
cúmulo fueron separadas empleando un vortex por 4
minutos en una solución buffer fosfato PBS
(Dulbecco´s) sin Ca2+ y Mg2+ con hialuronidasa(0,1%
)colocándolos después en el medio TCM-199 con
buffer Hepes (25mM). En este medio fueron
seleccionados aquellos ovocitos maduros, que
presentaron el primer corpúsculo polar
Fecundación in vitro.
Al medio que contenía los ovocitos maduros, se les
agregó 10 ul del cultivo de espermatozoides con
reacción del acrosoma. Se incubaron entre 24 y 120
horas a 39ºC con 5% CO2 y 90% de humedad
Pruebas estadísticas
Se emplearon las pruebas estadísticas de análisis de
varianza (ANOVA) para comparar si los patrones
de capacitación espermática y reacción del acrosoma
son significativamente distintos en los diferentes
momentos del estrés hipotérmico y la prueba de Tukey
por medio de la cual se realizó una comparación de
los grupos por pares, para establecer cual grupo marca
la diferencia. RESULTADOS
Hiperactivación y reacción del acrosoma
Los espermatozoides que permanecieron en estrés
hipotérmico entre 24 a 264 horas, adquirían el estado
capacitado y perdían su acrosoma cuando fueron
incubados a 37º C. En el cuadro N° 1 se puede
observar que no existe diferencia significativa, en
cuanto a hiperactivación entre los espermatozoides
que permanecieron hasta 120 horas en estrés
hipotérmico, sin embargo esta diferencia se aprecia
en los que estuvieron por 264 horas en hipotermia.
Con respecto al tiempo de inicio de la hiperactivación,
los espermatozoides recién extraídos de la cauda
demoran 2 horas mientras los que permanecieron en
estrés hipotérmico, lo logran a los 6º minutos del inicio
de la incubación a 37º C.
En el cuadro N°2, se presentan los porcentajes de
reacción del acrosoma a través del tiempo de
permanencia en hipotermia. La reacción del acrosoma
se evalúo 30 minutos después de agregar imidazol
5mM a las microgotas de espermatozoides
hiperactivos. Como se puede apreciar, el la reacción
del acrosoma es muy similar a las 24 hrs. (67,20 %),
72 hrs (66.88%) y 120 hrs.(66,80%) en estrés
hipotérmico, sin embargo existe una disminución de
reacción del acrosoma (47.90 %) en los que estuvieron
por 264 horas a baja temperatura.
Maduración de ovocitos
Los tipos de COCs seleccionados de ovarios de
hembra fueron madurados por 13 horas en el NCSU
23 con hormonas y después 12 horas en el medio sin
hormonas. Se utilizaron 283 COCs y se observó la
expansión del cúmulo sólo en 158 (55.8%). La
expansión del cúmulo es el indicador morfológico de
maduración.
Fecundación in vitro
Espermatozoides sin acrosoma se agregaron a los
ovocitos con cúmulo expandido y después de 24 horas
se verificaba la presencia de embrión de 2-células y
a las 120 horas si se había formado blastocistos .
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Se fecundaron ovocitos con espermatozoides que no
habían permanecido en hipotermia y con
espermatozoides de 72 y 120 horas de hipotermia.
En cada caso se utilizaron 50 ovocitos. En la tabla
N°1 se muestran los resultados preliminares obtenidos
donde se puede apreciar que el estrés hipotérmico
no es un factor limitante de la fecundación ni del
desarrollo embrionario temprano en cuy.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se demuestra que los
espermatozoides epididimarios de cuy en estrés
hipotérmico adquieren capacidad fértil hasta 264 horas
inclusive en el medio SM, en relación a los medios de
cultivo que contienen entre 0.25 a 0.33 mM de
piruvato en los cuales el tiempo máximo de viabilidad
alcanza sólo a 120 horas (Gonzales Figueroa, 1988).
Esto sugiere que el piruvato, en una concentración
elevada (22,3 mM), sería la fuente energética
preferida para mantener la supervivencia espermática
en estrés hipotérmico. Conjuntamente con las
sustancias que se encuentran en el fluido de la cauda
del epidídimo que inhiben capacitación y reacción del
acrosoma cuando los espermatozoides se encuentran
almacenados en la cauda (Bavister et al., 1978).
Los espermatozoides cuando abandonan el testículo,
lo hacen morfológicamente completos, pero no
funcionalmente (Austin, 1952). La funcionalidad total
se adquiere en el tránsito por el epidídimo y por el
tracto reproductor de la hembra o mediante la
capacitación espermática in vitro. Durante la
capacitación ocurren cambios en los patrones de
batimiento del flagelo espermático, fenómeno
conocido como hiperactivación (Yanagimachi, 1969).
El aumento de la motilidad de los espermatozoides
hiperactivos presumiblemente les ayuda a superar la
barrera de la mucosa del tracto reproductivo femenino
y es crucial para lograr la fecundación de los
gametos. Durante la capacitación los espermatozoides
experimentan una pérdida de colesterol de la
membrana, probablemente desde un microdominio de
membrana (glicoesfingolípido, colesterol y proteína),
que asociada al ingreso de bicarbonato de sodio desde
el medio (aparato reproductor femenino o su
equivalente in vitro) generan la activación de un
mecanismo original de transducción de señales Esta
vía conduce a fosforilación de residuos de tirosina en
proteínas específicas ricas en este aminoácido
(Boarelli et al, 2007). Es interesante tener en cuenta
que a partir de las 24 horas de estrés hipotérmico, la
capacitación espermática se logra 60 minutos después
del inicio de la incubación a 37°C, en relación a las 2
horas que demora este proceso en los
espermatozoides recién obtenidos del epidídimo. Esto
podría deberse a la formación de microdominios
lipídicos, provocado por el estrés hipotérmico, pero
que no compromete la integridad funcional de los
espermatozoides. Los valores de hiperactivación entre
24 a 120 horas en estrés hipotérmico son similares
con respecto a los espermatozoides de 264 horas
donde se evidencia una baja porcentual significativa
de hiperactivación.
Existen proteínas fosforiladas en tirosina como la
piruvato deshidrogenasa A2 (PDHA2) que es
requerida para la hiperactivación y la reacción del
acrosoma en espermatozoides de hamster (Kunar et
al., 2008) y otra, la dihidrolipoil deshidrogenasa (DLD)
que se mantiene fosforilada en tirosina durante la
capacitación de espermatozoides de mamíferos
(Mitra &. Shivaji, 2004). La presencia de estas
enzimas, servirían para regular la oxidación del
piruvato, y de esta forma provocar la hiperactivación
en el medio SM (22.3 mM de piruvato). A juzgar por
nuestros resultados estas enzimas no se deterioran
durante la permanencia de los espermatozoides de
cuy en estrés hipotérmico, puesto que los
espermatozoides de 24 horas y los de 264 horas
mantienen los patrones de hiperactivación y reacción
del acrosoma.
Sólo los espermatozoides hiperactivos inician la
reacción del acrosoma inducida por el imidazol
presente en el medio de cultivo. Existen evidencias
que algunas sustancias como el bicarbonato de sodio,
promueven la reacción acrosómica espontánea en
espermatozoides de hámster (Boatman & Robbins,
1991), es probable que el imidazol, sea un regulador
del pH del medio de cultivo y la variación de pH sea
una de las causas de la reacción acrosomal, pero no
se puede descartar que el imidazol pueda provocar,
también, la formación de microdominios lípidicos que
facilitarían la exocitosis acrosomica.
El desarrollo embrionario está influenciado
directamente por mecanismos que ocurren durante
la maduración del ovocito. Si bien es cierto que
muchos ovocitos inmaduros son capaces de completar
la meiosis in vitro, sólo un pequeño porcentaje de
ellos adquieren una correcta competencia de
desarrollo, para continuar hasta el estado de
blastocisto. Los ovocitos recolectados de ovarios
procedentes de mataderos son una fuente
extremadamente heterogénea en términos de calidad
y competencia de desarrollo (Brackett & Zuelke,
1993). De los 283 COCs de cuy seleccionados 158
(55.8%) maduraron en el medio NCSU 23
expandiendo el cúmulo, indicador importante de la
capacidad de competencia ovocitaria (Krisher, 2004).
Es interesante mencionar que es la primera vez que
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se usa este medio de cultivo para madurar con relativo
éxito ovocitos de cuy.
La eficiencia del medio de maduración ovocitaria,
sirvió para comprobar que los espermatozoides que
sobreviven en estrés hipotérmico prolongado, son
capaces de fecundar ovocitos maduros y además
iniciar el desarrollo embrionario hasta el estado de
blastocisto.
Se puede afirmar que sistemas de cultivo
quimicamente definidos, como el medio SM, permiten
que los espermatozoides de cuy sobrevivan en estrés
hipotérmico sin alterar su capacidad fértil.
LITERATURA CITADA
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Cuadro 1. ESPERMATOZOIDES HIPERACTIVOS EN ESTRÉS HIPOTERMICO
Cuadro 2. REACCIÓN DEL ACROSONA EN ESPERMATOZOIDES DE CUY EN ESTRES
HIPOTERMICO.
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Tiempo en estrés hipotérmico Número de ovocitos maduros 2-células blastocisto
Control (0 hrs) 50 31 (62 %) 19 (38.0 %)
72 hrs 50 23 (46 %) 15 (30.0 %)
120 hrs 50 19 (38 %) 17 (34.0 %)
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Tabla 1. Embriones obtenidos in vitro con espermatozoides que permanecieron en estrés
hipotérmico
