Biotempo 2006, Volumen 6,
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INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN «PAPAYO»
(CARICA PAPAYA LINNAEUS)
Antonietta Gutiérrez-Rosati1
Consuelo Jiménez
Jean Yépez Maraví
RESUMEN
El objetivo principal del presente estudio es desarrollar un sistema de regeneración eficiente
de plantas de papayo del cultivar PT-101-B, a través de embriogénesis somática.
Se utilizaron embriones de semillas de frutos de papayo. Los embriones cigóticos fueron
sembrados en medio basal Murashige-Skoog a mitad de concentración, suplementado con
sucrosa al 3% y gelrite al 0,3%. Se ensayaron concentraciones de 2, 5, 10 y 15 mg.l-1 de
acido 2,4-diclorofenoxiacetico. El pH del medio fue ajustado a 5,8. Las placas permanecieron
en oscuridad. Los callos embriogénicos fueron trasladados a medio basal Murashige-Skoog
suplementado con 0,15 y 0,2 mg.l-1 de 6-benzilaminopurina más 0; 0,15 y 0,2 mg.l-1 de
Kinetina. El material experimental fue expuesto a una intensidad lumínica de 2500 a 3000 lux
y un fotoperíodo de 12 horas luz.
Se comprobó que el medio de cultivo con 10 mg.l-1 de 2,4-diclorofenoxiacetico presenta la
concentración apropiada para inducir la formación de callos embriogénicos, llegando a presentar
un 90% de formación de callos embriogénicos. El medio de cultivo con 0,15 mg.l-1 de 6-
benzilaminopurina fue suficiente para promover la germinación, el desarrollo y enraizamiento
de los embriones somáticos.
Palabras claves: Acido 2,4-diclorofenoxiacético, 6-benzilaminopurina, callo
embriogénico, cultivo de tejido, fitohormona.
SUMMARY
The primary target of this work is to develop a system of efficient regeneration of papaya
plants of cultivar PT-101-B, through somatic embryogenesis. Embryos of seeds of papaya
fruits were used. The zygotic embryos were placed on half concentration basal Murashige-
Skoog media, supplemented with 3% sucrosa and 0.3% gelrite and concentrations of 2, 5, 10
and 15 mg.l-1 of 2,4-diclorofenoxiacetico acid. The plates with the embryos were placed in
the dark.
After the embryogenic callus were growth they were transferred to a basal Murashige-
Skoog media supplemented with 0.15 and 0.2 mg.l-1 of 6-benzilaminopurina and 0; 0,15 and
0.2 mg.l-1 of Kinetina.
During all experiments the explants were growth at 2500 to 3000 lux and photoperiod of 12
hours light. It was verified that the culture media with 10 mg.l-1 of 2,4-diclorofenoxiacetic
acid was the appropriate media to induce the formation of embryogeni callus, obtaining 90%
of embriogenic callus formation. The culture media with 0.15 mg.l-1 of 6-benzilaminopurina
were sufficient to promote the germination, development and rooting of the somatic embryos.
Key words: 2,4-diclorofenoxiacétic Acid, Embriogenic callus, tissue culture,
phytohormone.
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1 Universidad Nacional Agraria La Molina. P.O.Box 456 La Molina, Lima 12- Perú.
E-mail: antonietta@lamolina.edu.pe
Abreviaciones:
BA : 6-benzilaminopurina, 2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético, IBA: ácido indolbutirico, MS:Medio Murashige-
Skoog (BA : 6-benzilaminopurina, 2,4-D: 2,4-diclorofenoxiacétic ácid, IBA: indolbutiric ácido, MS: Murashige-
Skoog Media)
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INTRODUCCIÓN
El papayo, es un frutal semiperenne que
empieza la producción de frutos al año de
su siembra y mantiene la producción
anualmente por ocho o diez años
consecutivos, es debido a esta característica
que lo convierte en un frutal de aceptación
por los agricultores ya que permite un rápido
retorno del capital. Pese a ser un cultivo
adaptado y óptimo para el desarrollo de la
agroindustria, en el Perú, su expansión se
ve limitada por la falta de semilla mejorada
que brinde alta producción y productividad.
Adicionalmente otros factores como
deficiencias en la fertilización del cultivo,
falta de una adecuada política de
comercialización y presencia de plagas y
enfermedades, tales como el virus del
mosaico del papayo (PMV) y el virus de la
mancha anillada del papayo (PRV), se
convierten en factores detrimentales de su
optima producción y productividad. El PRV
ataca a las plantas de papayo que se
encuentran en edad de producción no
llegando éstas al segundo año de vida.
Muchos de los países afectados por este
virus, han emprendido campañas para la
identificación de genotipos resistentes a
este virus sin resultados positivos, por ello
se han visto en la necesidad de incorporar
a sus programas de mejoramiento la
tecnología de transformación genética,
habiendo logrado desarrollar plantas
transgénicas de papayo resistentes al virus
PRV. El éxito de esta tecnología consiste
en tener a disposición una eficiente
metodología de regeneración que asegure
un buen numero de plantas transformadas.
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
El presente estudio fue desarrollado
utilizando semillas inmaduras de papayo de
la variedad PT-101-B, variedad obtenida
por el Instituto de Investigaciones de la
Amazonía Peruana (IIAP), en su Centro
de Investigación localizado en Tingo María,
quienes proporcionaron el material vegetal.
INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL
VEGETAL A CONDICIONES IN
VITRO
Se abrieron los frutos y se extrajeron las
semillas inmaduras, las cuales fueron
esterilizadas con una solución de hipoclorito
de sodio, se extrajeron el integumento
interno y el endospermo, para luego
proceder a la extracción y siembra de los
embriones inmaduros.
Inducción y desarrollo embriogénico.
Los embriones inmaduros extraídos, fueron
sembrados en un medio de inducción
embriogénica, el cual estuvo compuesto por:
Medio MS básico a media concentración
suplementado con 0, 4 mg. l de tiamina–
HCl, 0,5 mg. l-1 de piridoxina-HCl, 0,5 mg.
l-1 ácido nicotínico, 2,0 mg. l-1 glicina, 0,4
mg.l-1 glutamina, 3% sucrosa y 0,3% de gel-
rite como agente gelificante. Se ajusto el
pH del medio a 5,8 previo al autoclavado.
Luego de esterilizado el medio y cuando
este alcanzo una temperatura aproximada
de 60ºC se adicionó al medio de cultivo
ácido 2,4-diclorofenoxiacético esterilizado
por filtración. Se analizaron cuatro
diferentes concentraciones de 2,4 –D (0,
2, 5, 10, 15 ppm), constituyéndose en los
tratamientos para la inducción
embriogénica. Los embriones así
sembrados, se cultivaron en condiciones de
oscuridad a 25ºC, haciendo cambios
mensuales del medio. Los callos en
formación se observaron diariamente, y los
datos de evaluación se registraron
mensualmente a partir de la fecha de
siembra.
Crecimiento (germinación) de los
embriones somáticos
Los embriones formados, se transfirieron
a nuevos medios que permitiesen su
crecimiento, para ello se analizaron
diferentes medios, estando estos
constituidos por: Medio MS básico
suplementado con 0, 4 mg. l de tiamina–
HCl, 0,5 mg. l-1 de piridoxina-HCl, 0,5 mg.
l-1 ácido nicotínico, 2,0 mg. l-1 glicina, 0,4
mg.l-1 glutamina, BAP (0,15mg.l-1 y 0,2 mg.l-
1), kinetina (0,05 mg.l-1 y 0,1 mg.l-1), se
ajusto el pH del medio a 5,8 previo al
autoclavado.. El material sembrado fue
cultivado en cuarto aclimatado a una
temperatura de 25°C, 12 horas de luz como
fotoperíodo, siendo mantenidos en este
medio hasta observarse la presencia de
embriones en el material sembrado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Introducción del material vegetal a
condiciones in vitro
De los diferentes tratamientos con
concentraciones y tiempos de exposición a
la solución esterilizadora de hipoclorito de
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sodio, se encontró que el tratamiento de 25
minutos con una solución al 1 % resulta
eficiente.
(El protocolo de desinfección de semillas
de papayo de Litz y Conover es eficiente.
Los embriones cigóticos de la variedad
estudiada responden muy bien a esta
técnica.)
Se observo que luego de ser extraídos los
embriones de las coberturas seminales,
deben ser estos sembrados de inmediato a
fin de evitar su deshidratación y
contaminación.
Inducción y desarrollo embriogénico.
De los tratamiento estudiados en la fase
inductiva, se encontró que el medio control
(sin presencia de auxinas) favoreció la
germinación de los embriones inmaduros
sembrados y en el lapso de una semana se
convirtieron éstos en plántulas.
Conforme el explante permanece en el
medio inductor, se va formando el callo
embriogénico, el cual empieza a proliferar
a partir de los meristemos apical y radicular
del embrión. Los callos embriogénicos se
observan como células isodiamétricas de
coloración amarilla y de consistencia frágil
(Fotografía 1) que exudan un líquido claro
y denso.
Foto 1 : Callo embriogénico
La cantidad de callo embriogénico se
incrementa en el explante conforme este
es transferido a medios frescos con la
presencia de auxina, de esta forma se
inducen a sucesivas fases embriogénicas
(embriogenesis secundaria), así se pudo
observar que al cabo de tres meses
algunos de los tratamientos alcanzaron
hasta un 80 u 85% de callos
embriogénicos. Igualmente se observo
que los callos embriogénicos inducidos
durante la primera etapa de exposición
a la auxina logran desarrollar hasta
embriones maduros en la etapa en la
cual la auxina desciende en su
concentración en el medio debido a
consumo o pérdida de efectividad de la
misma por el tiempo que esta se
encuentra en el medio. De los
tratamientos utilizados, se observó que
el tratamiento con (10 ppm) de 2,4-D
mostraba el nivel mas alto de formación
de callos embriogénicos asi como
embriones somáticos, por lo que se
seleccionó a este tratamiento como el
mas eficiente a ser utilizado en futuros
experimentos.
Porcentaje de formación de callo
embriogénico
Concentración de 2,4-D (mg/L)
Crecimiento (germinación) de embriones
somáticos y análisis del proceso embriogénico.
De los tratamiento realizados a fin de
observar el efecto de la Kinetina y el BAP
en el crecimiento de los embriones
somáticos encontramos que estos no
prosperan cuando son seccionados
individualmente para ser sembrados en
los medios de crecimiento, pero si
respondían a estos cuando eran
trasladados conjuntamente con la masa
se callo. Se pudo observar igualmente
que la desecación del embrión antes de
ser éste sembrado en el medio favorecía
su crecimiento, mientras que aquellos no
desecados se vitrificaban con facilidad.
Otro aspecto observado en el estudio es
la ocurrencia de abortos embrionarios
en el estadío de torpedo, fusión de
embrioides, formación de callos en la
estructura embrionaria o embriones con
cotiledones supernumerarios, hecho
reportado también por Litz (Litz et al.,
1982).
Los embriones somáticos fueron sembrados
en los tratamientos, observándose el mayor
porcentaje de germinación en el tratamiento
que contiene 0.2 mg.l-1 BAP (Foto 2). A
medida que la concentración de BAP y
kinetina aumentan, se incrementa la
frecuencia de formación de plántulas con
raíces callosas, y tallos con base callosas.
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Foto 2: Embriones somáticos, explante
tratado con 0.2 mg.l-1 BAP
Efecto del IBA y la Riboflavina en el
enraizamiento de brotes
Los embrioides germinados y brotes
formaron fueron trasladados a medios de
inducción de raices conteniendo: medio
basico MS (1962), suplementado con ácido
indolbutirico y riboflavina (vitamina B2),
3% de sucrosa (tabla 3), ajustando a un
pH de 5,8; los explantes fueron cultivados
durante un mes a condiciones controladas
de fotoperíodo y temperatura para inducir
la formación de raíces. La riboflavina
descompone el IBA en presencia de luz,
evitando que la prolongada exposición al
regulador induzca la formación de callos en
la base de los tallos (Drew et al., 1993
Los resultados del experimento de
enraizamiento usando IBA y riboflavina
mostraron que en realidad no existe una
diferencia significativa entre ambos
tratamientos. Las raíces formadas
generalmente fueron de apariencia gruesas
(Foto 3).
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Foto 3:
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