RESUMEN

Introducción: La "mashua", Tropaeolum tuberosum, es una especie vegetal nativa del Perú. Investigaciones realizadas han comprobado sus efectos sobre la fertilidad de mamíferos. Objetivo: Evaluar la acción biológica de la solucion acuosa de T. tuberosum en el desarrollo de los embriones preimplantacionales de Mus musculus y la capacidad reproductiva de Mus musculus macho. Métodos: Estudio experimental preclínico de casos y controles. La muestra estuvo conformada por 32 ratones, el grupo casos lo conformó 24 ratones agrupados en tres grupos, cada uno de 8 ratones, a quienes se les administró extracto acuoso ad libitum, en una concentración de 50 g/Kg de peso corporal durante 8, 16 y 35 días respectivamente, el grupo control lo integró 8 ratones, quienes recibieron sólo agua de grifo. Cada grupo de machos se cruzaron con hembras de edad fértil, la presencia de tapón vaginal nos indicó el día 0 de desarrollo embrionario. A las 72 h se perfusionaron los cuernos uterinos y oviductos y se evaluó el grado de desarrollo, condición y morfología embrionaria preimplantacional de Mus musculus hasta alcanzar el estadío blastocisto. Resultados: Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de casos y control. Nuestros resultados demuestran que la administración de solución acuosa de T. tuberosum a ratones machos, altera la calidad reproductiva del ratón afectando la capacidad del embrión para desarrollarse normalmente hasta el estadio de blastocisto. Conclusión: El extracto acuoso de Tropaeolum tuberosum (mashua) afecta el desarrollo embrionario preimplantacional y la capacidad reproductiva en Mus musculus macho.

Palabras Clave: Mashua; Tropaeolum; Dominancia fetal; Desarrollo preimplantacional (fuente: DeCS BIREME).

ABSTRACT

Introduction: The "mashua", Tropaeolum tuberosum, is a plant species native to Peru. Research carried out has proven its effects on the fertility of mammals. Objective: To evaluate the biological action of the aqueous solution of T. tuberosum in the development of preimplantation embryos of Mus musculus and the reproductive capacity of male Mus musculus. Methods: Preclinical experimental study of cases and controls. The sample consisted of 32 mice, the case group was made up of 24 mice grouped into three groups, each one of 8 mice, to whom aqueous extract was administered ad libitum, at a concentration of 50 g / Kg of body weight for 8, 16 and 35 days respectively, the control group consisted of 8 mice, who received only tap water. Each group of males were crossed with females of fertile age, the presence of a vaginal plug indicated day 0 of embryonic development. At 72 h the uterine horns and oviducts were perfused and the degree of development, condition and preimplantation embryonic morphology of Mus musculus were evaluated until reaching the blastocyst stage. Results: Statistically significant differences were found between the case and control groups. Our results show that the administration of aqueous solution of T. tuberosum to male mice alters the reproductive quality of the mouse, affecting the ability of the embryo to develop normally until the blastocyst stage. Conclusion: The aqueous extract of Tropaeolum tuberosum (mashua) affects preimplantation embryonic development and reproductive capacity in male Mus musculus

Keywords: Mashua; Tropaeolum; Fetal dominance; Preimplantational development (source: MeSH NLM).

INTRODUCCIÓN

Mashua (Tropaeolum tuberosum), pertenece al grupo de tubérculos que crecen en la región andina, y ha sido utilizado desde tiempos muy antiguos como fuente de alimento y medicina por los nativos, y algunas de sus propiedades biológicas estarían relacionadas con ciertas sustancias como compuestos fenólicos, glucosinolatos, isotiocianatos y antocianinas.^(1,2,3) Johns et al.⁽⁴⁾ sugirieron un efecto anti-reproductivo de Mashua en ratas macho debido a una caída del 45% de testosterona / dihidrotestosterona en muestras de sangre, sin mostrar ningún efecto sobre la capacidad de embarazar hembras de rata. Sin embargo, en otro estudio no se observaron diferencias en los niveles séricos de testosterona entre las ratas tratadas con un vehículo o Mashua durante 42 días, pero se observó una reducción en el número de espermátides testiculares y la producción diaria de esperma del día 12 al día 42 del tratamiento. Debido a ello, los efectos hipotéticos de Mashua estarían relacionados con la alteración de la función testicular al reducir el número, la producción diaria y al afectar el tiempo de tránsito del esperma epididimario⁽⁵⁾.

En el estudio de Leiva-Revilla et al⁽⁶⁾ se observó, en ratas macho tratadas con Mashua, una disminución en la producción diaria de esperma y en el número de espermatozoides epididimarios y deferentes, así como una disminución en la motilidad de los espermatozoides; Por otro lado, Mashua aumentó el porcentaje de morfología de esperma anormal y la tasa de tránsito de esperma epididimario. Estos efectos en ratas macho tratadas con Mashua fueron reversibles después de 24 días de tiempo de recuperación. En otro estudio, los ratones tratados con un extracto hidroalcohólico de Mashua mostraron una disminución en la motilidad progresiva de los espermatozoides y el recuento de espermatozoides en el epidídimo caudal, y un aumento en el recuento de espermatozoides inmóviles después de 21 días de tratamiento⁽⁷⁾. Los efectos anti-reproductivos de Mashua estarían relacionados con el alto contenido de p-metoxibencil-glucosinolato, su transformación en isotiocianatos por la enzima mirosinasa intestinal y sus propiedades antiproliferativas y proapoptóticas^(8,9,5)

Por lo mencionado, el objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto del extracto acuoso de T. tuberosum en el desarrollo de los embriones preimplantacionales de Mus musculus y la capacidad reproductiva de Mus musculus macho.

MÉTODOS

Diseño y área de estudio

Estudio experimental pre clínico de casos y controles, área de biología experimental.

Población y muestra

La muestra estuvo conformada por 32 ratones (Mus musculus), de la cepa albina suiza (Swiss Rockefeller), el grupo casos (experimental) lo conformó 24 ratones agrupados en tres grupos, cada uno de 8 ratones, a quienes se les administró extracto acuoso ad libitum, en una concentración de 50 g/Kg de peso corporal durante 8, 16 y 35 días respectivamente, el grupo control lo integró 8 ratones, quienes recibieron sólo agua de grifo. 24 ratones machos con 6-8 semanas de edad, se mantuvieron en una habitación con temperatura controlada (22-25 ° C) con ciclos de luz y oscuridad de 12 h, y se proporcionó agua y comida para ratones ad libitum.

Variables

Variables independientes: Sexo (macho, hembra), tratamiento ratones machos, hembras preñadas día 1 y día 4, peso hembras preñadas día 1 y día 4, presencia de cuerpo lúteo, número de embriones, grado embrionario, estadío del embrión.

Variables dependientes: calidad reproductiva del ratón macho, desarrollo embrionario preimplantacional.

Se realizó una ficha de recolección de datos con todas las variables del estudio de investigación donde se registraron los hallazgos encontrados.

Procedimientos

1. Preparación de extracto acuoso: Tubérculos de mashua se obtuvieron en fuentes comerciales (Lima, Perú) y se procesaron hasta obtener una pasta en el Instituto de Recursos Naturales, Facultad de Farmacología, en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
   La pasta se disolvió en agua destilada (50 mg de pasta por ml) y se almacenó a 4º C hasta su uso.


2. Tratamiento: Ratones machos de edad fértil se seleccionaron al azar y se colocaron en jaulas individuales para los bioensayos. Se establecieron tres grupos experimentales de 8 ratones cada uno que bebieron ad libitum durante 8, 16 y 35 días un extracto acuoso de mashua a la concentración de 50 mg / ml. El grupo de control bebió agua del grifo. Se reemplazó un nuevo suministro de extracto cada 24 h, y se registraron los volúmenes ingeridos todos los días.
   Las hembras nulíparas fueron enjauladas individualmente con los ratones machos durante la noche. A la mañana siguiente las hembras con presencia de tapón vaginal, fueron consideradas hembras postcoito, en día 1 de embarazo. Sólo quedaron preñadas 7 ratonas del grupo control y 7 del día de tratamiento 35, de los días 8 y 16 de tratamiento quedaron cruzadas 8 ratonas en cada día.


3. Diferenciación temprana y escala de embriones preimplantaciónales de ratón Después del tratamiento, los ratones machos fueron enjaulados con ratones hembra nulíparas. Se observó la presencia de tapón vaginal en las hembras para determinar si se produjo la cópula. Las hembras preñadas se mantuvieron hasta 4 días. En el día 4 de preñez, los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical, se aislaron los oviductos y cuernos uterinos en una placa embriológica y se perfusionaron con solución de Fosfato Buffer Salino  (PBS) (pH 7), obteniendo los embriones para su posterior evaluación.
   Se establecieron tres categorías de gradación para clasificar a los embriones: 1) Grado I: excelente o bueno; 2): Grado II: regular; 3) Grado III: pobre; 4) Degenerado (10) . El sistema de gradación es el siguiente: 1) Grado I: embriones con una masa simétrica, blastómeros uniformes en tamaño, color y densidad por lo menos con un 85% del material celular intacto, masa embrionica viable; 2) Grado II: embriones con una moderada irregularidad en su forma, tamaño, color y densidad de células individuales, por lo menos en un 50% del embrión integro; 3) Grado III: embriones con una mayor irregularidad en forma, tamaño, color y densidad del células individuales por lo menos en un 25% del embrión integro; 4) Degenerado: embriones u ovocitos muertos o severamente deteriorados, oocitos o embriones de una celula no viables⁽¹¹⁾.

Análisis estadístico:

Se utilizó el software estadístico SPSS V25.0. Las diferencias en el peso se analizaron mediante ANOVA. Las etapas de desarrollo y los grados de calidad embrionaria se analizaron mediante la prueba de de chi-cuadrado.

Aspectos éticos:

El cuidado y manejo de los animales se realizó de acuerdo con las pautas éticas de nuestra institución.

RESULTADOS

Hubo una diferencia en el peso materno entre un grupo (Trat35D) y los otros tratamientos grupales experimentales en el día 1 de preñez. Este evento desapareció en el día 4 de preñez sin mostrar ninguna diferencia estadística entre los grupos experimentales. No hubo diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento en relación con el número de embriones y cuerpos lúteos (tabla 1).



La evaluación de la diferenciación temprana en embriones preimplantacionales de ratón mostró que el grupo de control produjo 78,57% de blastocistos, 20% de mórula compactada y 1,43% de embriones en otras etapas de desarrollo tardío. Los ratones machos del grupo casos de 8 días de ingesta de extracto acuoso ad libitum, en una concentración de 50 g/Kg de peso corporal produjeron 80,56% de blastocistos, 4,17% de mórula compactada y 15,28% de embriones en otras etapas tardías de desarrollo. Los casos de 16 días produjeron el 71,79% de los blastocistos, el 2,56% de la mórula compactada y el 23,08% de los embriones en otras etapas tardías de desarrollo. Finalmente, los casos de 35 días produjeron el 80% de los blastocistos, el 1,43% de la mórula compactada y el 18,57% de los embriones en otras etapas tardías de desarrollo (Tabla 2).



Estos resultados indican un incremento progresivo en el número de embriones retrasados que no pasaron la etapa de mórula compactada en relación con los progenitores de ratones machos tratados con extracto acuoso de mashua. Las diferencias entre el control y los grupos experimentales fueron estadísticamente significativas.

La evaluación de la calidad del embrión mostró en el grupo de control que el 97.14% correspondió al Grado 1-Grado 2 (embriones con la mejor puntuación: mejor aspecto, blatómeros de igual tamaño y con poca o ninguna fragmentación de citoplasma), mientras que el 0% correspondió al Grado 3, y 2.86% a embriones degenerados (embriones con la peor puntuación: aspecto irregular, blastómeros de tamaño desigual y con fragmentación de citoplasma)

Los progenitores de ratones machos que bebieron el extracto acuoso de mashua durante 8 días produjeron 79,17% de embriones correspondientes a Grado I-Grado II, mientras que 8,33% eran de Grado III y 12,5% eran embriones degenerados. Los progenitores de ratones machos que bebieron el extracto acuoso de mashua durante 16 días produjeron el 73,07% de embriones correspondientes al Grado I-Grado II, mientras que el 2,56% eran de Grado III y el 24,37% eran embriones degenerados. Los progenitores de ratones machos que bebieron el extracto acuoso de mashua durante 35 días produjeron 67,14% de embriones correspondientes a Grado I-Grado II, mientras que 14,29% eran de Grado III y 18,57% eran embriones degenerados (Tabla 3). Estos resultados indican una disminución progresiva en la calidad del embrión en relación con los progenitores de ratones machos tratados con extracto acuoso de mashua. Las diferencias entre el control y los grupos experimentales fueron estadísticamente significativas.



Estos resultados indican un incremento progresivo en el número de embriones retrasados que no pasaron la etapa de mórula compactada en relación con los progenitores de ratones machos tratados con extracto acuoso de mashua. Las diferencias entre el control y los grupos experimentales fueron estadísticamente significativas.

La evaluación de la calidad del embrión mostró en el grupo de control que el 97,14% correspondió al Grado I-Grado II (embriones con la mejor puntuación: mejor aspecto, blatómeros de igual tamaño y con poca o ninguna fragmentación de citoplasma), mientras que el 0% correspondió al Grado III, y 2,86% a embriones degenerados (embriones con la peor puntuación: aspecto irregular, blastómeros de tamaño desigual y con fragmentación de citoplasma)

DISCUSIÓN

Tres mecanismos pueden explicar por qué la calidad de los espermatozoides afecta a la embriogénesis: 1) actividad transcripcional débil en el pronúcleo masculino, 2) señalización anormal de calcio que produce fallas de activación en los ovocitos y alteraciones del desarrollo pronuclear y, 3) anormalidades en el aster derivado de los espermatozoides que resultan en ambos aposición inadecuada del pronúcleo^(12-14) y fallas en la mitosis ^(15-17).

En una investigación previa, realizada en nuestro laboratorio se observó que el extracto acuoso de Mashua afectaba la morfología de la cabeza y el flagelo en los espermatozoides obtenidos del epidídimo en ratones. Por lo general, las alteraciones de la morfología dan testimonio de material genético anormal del espermatozoide⁽¹⁸⁾. Estos resultados son similares a otros estudios que sugieren un posible efecto del extracto de mashua en espermatocitos secundarios y espermátidas redondas durante la espermatogénesis de ratones^(6,7) . La espermatogénesis es el proceso por el cual las células germinales inmaduras sufren división, meiosis y diferenciación para dar lugar a espermátidas alargadas haploides⁽¹⁹⁾. Cuando se completa el desarrollo de las células germinales, las espermátidas maduras ingresan al epidídimo, donde adquieren movilidad y capacidad de fertilización del óvulo. En la regulación endocrina y paracrina de la espermatogénesis, la producción de testosterona por las células de Leydig es esencial por sus efectos biológicos en los testículos y la espermatogénesis en su conjunto^(20,21). En la espermiogénesis ocurre la formación del acromosoma y el flagelo, la reordenación nuclear, la condensación de cromatina, el empaquetamiento del ADN, la acumulación de ARNm en el núcleo y la eliminación del citoplasma de los espermatozoides^(22-24). El tratamiento con mashua afecta la morfología de los espermatozoides y produce espermatozoides con una capacidad alterada para producir embriones preimplantacionales normales, y este hecho estaría relacionado con algún tipo de alteración genética en los espermatozoides.

Se sabe que la calidad del esperma depende de la condensación de cromatina y la integridad nuclear de los gametos^(24,25). Por otro lado, se requieren gametos de alta calidad para producir embriones de alta calidad, y que ambos genomas de gametos contribuyen al genoma embrionario^(26,27). Los estudios experimentales han demostrado que el desarrollo de embriones de mamíferos depende en parte de la integridad del ADN de los espermatozoides y la calidad genética en las células de los espermatozoides puede causar la detención en el desarrollo embrionario temprano^(27-29). Si la integridad del ADN se ve afectada, se produce un desarrollo embrionario lento, se produce un potencial disminuido para alcanzar la etapa de blastocisto produciendo embriones con morfología alterada y características de bajo puntaje^(30-32). El embrión de baja calidad está estrechamente relacionado con la calidad del ADN de los espermatozoides y esta relación puede evaluarse en el embrión teniendo en cuenta el número celular, la morfología, el tamaño y la fragmentación de blastómeros^(11,33,34). En la fragmentación de embriones, la pérdida de porciones de citoplasma está relacionada con la citocinesis o apoptosis imperfecta^(15-17) y estos eventos producen distorsión de los planos de división celular o interferencias con el contacto normal de células a células, lo que conduce a una compactación, cavitación y cavitación anormales. formación de blastocistos⁽³⁵⁾. En humanos, el ARNm heredado por vía materna controla las divisiones iniciales del cigoto; y el genoma embrionario está inactivo hasta la etapa de 4 células, después de la cual comienza la expresión de genes derivados de esperma, de modo que la influencia paterna en el desarrollo embrionario debería ser obvia hasta el día 8 -célula etapa^(27,36,37).

La reducción significativa en el número de embriones en la etapa de mórulas y un aumento no significativo en los embriones en la etapa indeterminada, así como una reducción en la calidad de los embriones podrían estar relacionados tanto con la integridad del ADN afectado en el esperma como con la alteración de la activación del genoma en los embriones tempranos (4 a 8 células), y la alteración del complejo centrosomal de la célula de esperma que podría afectar la mitosis en el embrión^(14,27), lo que llevaría a un retraso en el desarrollo del embrión.

El daño del ADN espermático puede ocurrir por condensación defectuosa de cromatina, alteración de la integridad del ADN o por estrés oxidativo resultante de especies reactivas de oxígeno (ROS)^(19,38,39). Es probable que los espermatozoides de ratones expuestos a sustancias bioactivas del extracto acuoso de mashua sufran alguna alteración durante la espermatogénesis, lo que causaría una disminución de su calidad genética que afecta tanto la expresión génica en el aparato pronúcleo masculino como el mitótico. Los isotiocianatos de mashua (ITC) son compuestos bioactivos derivados de glucosinolatos^(40,42). Se ha sugerido que la acción de ITC está relacionada con la inducción de daño en el ADN, la inhibición de la síntesis de ADN, la alteración del empaque de cromatina por acetilación de histonas, la activación de la apoptosis, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), el estrés oxidativo, y la represión genética del receptor de andrógenos (AR)^(43-45). Los elementos de radicales libres como ROS pueden afectar la calidad del ADN espermático^(38,39). El ITC induce la producción de ROS, y el estrés oxidativo está asociado con el daño del ADN. Independientemente del origen de ROS, su presencia puede causar fragmentación del ADN espermático, afectando tanto la integridad genómica como el desarrollo embrionario después de la fecundación^(38,39,19). El ITC puede unirse covalentemente a proteínas, inactivando actividades enzimáticas^(46,49). Por otro lado, el p-metoxibencil-glucosinolato presente en mashua muestra propiedades antiproliferativas y proapoptóticas respectivamente^(8,9). Tanto las acciones de ITC como de p-metoxibencil-glucosinolato afectarían la espermatogénesis de los ratones, la producción de espermatozoides, la calidad de los espermatozoides y el desarrollo embrionario que altera la activación del genoma masculino, el complejo centrosomal y la mitosis.

En nuestros resultados hay un grupo de embriones obtenidos de espermatozoides expuestos a mashua para alcanzar la etapa de blastocisto que exhiben una calidad embrionaria aceptable. En ratas, el tratamiento con isotiocianato de bencilo, un componente principal en Tropaeolum tuberosum, mostró un aumento no significativo dependiente de la dosis en las resorciones fetales tempranas antes de la implantación, no hubo diferencias significativas en el número de sitios de implantación, y no hubo diferencias significativas en el número de resorciones fetales, lo que permitió concluir que la acción de esta molécula no cambió los resultados del embarazo durante los períodos pre y postimplantación en ratas⁽⁴⁹⁾. Estos hechos podrían indicar que la capacidad de desarrollo de los embriones de ratones no se vería afectada de manera permanente e irreversible por el tratamiento con mashua, y la capacidad de los embriones para completar su desarrollo durante el período de embarazo no se vería afectada.

Los espermatozoides de baja calidad producen embriones de baja calidad. Esto es evidente en relación con los espermatozoides expuestos a mashua por el incremento en el número de embriones retrasados que no pasaron la etapa de mórula compactada después de la fertilización. Sin embargo, este efecto no sería permanente y es posible la capacidad de los embriones para completar su desarrollo hasta el final del embarazo.

Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con mashua produce una reducción significativa en el número de embriones en la etapa de mórulas y un aumento no significativo en los embriones en la etapa indeterminada, así como una reducción en la calidad y la capacidad de los embriones para desarrollarse normalmente hasta alcanzar la etapa de blastocisto.

La limitación de nuestro trabajo de investigación definitivamente es la muestra ya que es un trabajo preliminar, una muestra más grande asegura una distribución representativa de la población y ser considerados representativos de los grupos de personas, objetos, procesos, etc., estudiados. Aunque, por supuesto, el tamaño de la muestra es menos relevante en la investigación cualitativa.

CONCLUSIONES

El tratamiento con mashua produce una reducción significativa en el número de embriones en la etapa de mórulas y un aumento no significativo en los embriones en la etapa indeterminada, así como una reducción en la calidad y la capacidad de los embriones para desarrollarse normalmente hasta alcanzar la etapa de blastocisto.

Los espermatozoides de baja calidad producen embriones de baja calidad. La calidad espermática de los ratones expuestos a la acción de la mashua disminuye; debido a esto se incrementa el número de embriones retrasados que no pasaron la etapa de mórula compactada después de la fertilización. Es posible, que este efecto no sea permanente y que los embriones mantengan la capacidad de completar su desarrollo hasta el final de la preñez.

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Contribuciones de autoría: Los autores participaron en la génesis de la idea, diseño del proyecto, desarrollo, recolección e interpretación de data, análisis de resultados y preparación de manuscrito.
Financiamiento: Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional de San Marcos (Proyecto de investigación RR. N° 00251-R-11).
Conflicto de interés: Los autores declaran no tener conflicto de interés en la publicación de este artículo.
Recibido: 28 de junio 2020
Aprobado: 07 de agosto 2020

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Correspondencia: José Luis Rafael Pino Gavino.
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