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ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2017, 14(2), jul-dec.: 233-243.
Biotempo (Lima)
REVIEW ARTICLE / ARTÍCULO DE REVISIÓN
MAMMALIAN SPERMATOGONIAL CELLS
LAS ESPERMATOGONIAS DE MAMIFEROS
Hugo Gonzales Figueroa & Hugo Mauricio Gonzales Mol no
Laboratorio de Biotecnología Animal. Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Ricardo Palma. Lima, Perú
hgonzales gueroa0@gmail.com
ABSTRACT
In recent years, the scienti c community is becoming increasingly interested in the knowledge of the biology of
spermatogonia. is mini-review aims to announce the progress made in the origin and migration of primordial germ
cells, their propagation and renewal, in vitro culture methods as well as the perspectives of the use of spermatogonial
stem cells (SSCs) of mammals, mainly in regenerative biology. Mammalian spermatogonial stem cells are a population
of cells that are found in very small amounts at the periphery of the seminiferous tubules, from which spermatozoa are
produced continuously, throughout the life of the males. e SSCs, are the unique adult stem cells that, at this biological
complexity level, can be recognized it which allows to deepen investigations about its organization and functions in
biological models, di erent from the most studied mouse, such as humans, cattle, canines, for the importance of its
knowledge in the use of strategies in reproductive biotechnology and in regenerative biology.
Key words: in vitro culture – Spermatogonial stem cells (SSCs) – primordial germ cells
RESUMEN
En los últimos años, la comunidad cientí ca se está interesando cada vez más por el conocimiento de la biología de la
espermatogonia. Esta mini revisión tiene por nalidad divulgar algunos avances realizados acerca del origen y migración
de las células germinales primordiales, de su propagación y renovación, de los métodos de cultivo in vitro, así como de
las perspectivas del uso, de las células madre espermatogoniales (SSCs) de mamíferos, principalmente, en la biología
regenerativa. Las células madre espermatogoniales de mamífero son una población de células que se encuentran en
cantidades muy pequeñas en la periferia de los túbulos seminíferos, a partir de la cual se producen espermatozoides de
manera continua, durante toda la vida de los machos y además, son las únicas células madre adultas que, en este nivel
de complejidad biológica, pueden ser reconocidas; lo que permite profundizar investigaciones sobre su organización
y funciones en modelos biológicos, diferentes al ratón el más estudiado, como en humanos, bovinos, caninos, por la
importancia que tiene su conocimiento en la utilización de estrategias en biotecnología reproductiva y en la biología
regenerativa.
LIMA - PERÚ
Volumen 14 (2) Julio - Diciembre 2017
Revista Biotempo
Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma
(FCB-URP)
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Mammals spermatogonial cells
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INTRODUCCIÓN
Los mamíferos aseguran su variabilidad genética
mediante los eventos mitóticos y meióticos que se
originan en células diploides denominadas Células
Madre Espermatogoniales cuya sigla: SSCs, proviene
del inglés Spermatogonial Stem Cells. Estas células
diploides constituyen el reservorio a partir del cual
se producen espermatozoides de manera continua,
durante toda la vida de los machos mamíferos. Estas
SSCs existen en cantidades muy pequeñas en la
periferia de los túbulos seminíferos, contándose en los
roedores alrededor de 35.000 SSCs, que constituyen
aproximadamente el 0,03% del total de su masa
testicular (Tegelenbosch & de Rooij, 1993); sin
embargo, a pesar de su escasez, son las únicas células
madre adultas que, en este nivel de complejidad,
pueden ser reconocidas y esto permite profundizar
investigaciones sobre su organización y funciones
biológicas en diversos modelos biológicos como el ratón,
el más estudiado, humanos, bovinos, caninos, entre
otros por la importancia que tiene su conocimiento
en la utilización de estrategias en biotecnología
reproductiva y en la medicina regenerativa.
Las SSCs constituyen una población heterogénea
que muestra distintos grados de diferenciación. Las
espermatogonias As (simple) son consideradas como las
SSCs en los mamíferos no primates; en los roedores las
SSCs son las de tipo A; en caninos se han identicado
espermatogonias A0, que son las que cumplen la función
de reserva y dan origen a las espermatogonias A1 (Travis
et al., 2009). En bovinos (Aguilar et al., 2004) las
espermatogonias tipo A se han dividido en BSC (basal
stem cell), ASPC (agregated spermatogonial stem cell)
y CSPC (commited spermatogonial precursor cell) y en
humanos se distinguen tres tipos de espermatogonias:
oscuras (Ad), pálidas (Ap) y espermatogonias B (B),
dentro de las Ad, se encuentran las SSCs. En todos
los casos las células madre espermatogoniales (SSCs) se
encuentran en íntimo contacto con la membrana basal
del túbulo seminífero y en circunstancias normales no
tienen actividad proliferativa, pero entran en mitosis
cuando el número de espermatogonias desciende
dramáticamente.
Las propiedades de multipotencia y autorenovación
de estas células madre espermatogoniales, les permite
en condiciones adecuadas dividirse indenidamente
conservando una población estable de SSCs, que
en ambientes apropiados y recibiendo los estímulos
adecuados pueden diferenciarse hacia diferentes tipos
de células especializadas de un organismo adulto (Das
et al., 2008), son razones sucientes para hacer una
revisión que contribuya a entender mejor algunos
aspectos relacionados con la biología y cultivo in vitro
de estas células madre adultas, así como las perspectivas
de aplicaciones en la medicina regenerativa.
Origen y migración de las células germinales
primordiales
Durante el desarrollo embrionario de los mamíferos, al
inicio de la gastrulación, del embrioblasto se diferencia
el epiblasto (Boucher & Pedersen, 1996), donde se ori-
ginan (Montiel-Eule et al., 2001) las precursoras de
las células germinales primordiales (del inglés PGCs),
que son especicadas porque expresan algunos marca-
dores que también se expresan en las células germina-
les, como SSEA-1, F9, EMA, Oct4 y fosfatasa alcalina
(Ying et al., 2002). En embriones de ratón, cuando
se está formando el surco primitivo entre los 7 y 7
1/2 días después del coito (dpc), se observan peque-
ñas agrupaciones de células provenientes del epiblasto
que dan positivo a la fosfatasa alcalina y que han sido
identicadas como las células precursoras (Lawson &
Hage, 1994) de las PGCs; en humanos algunas PGCs
son observadas en el epiblasto entre 12-14 dpc (De Fe-
lici, 2013).
Estas PGCs migran y se establecen transitoriamente
en el mesodermo extraembrionario, principalmente en
el alantoides (Ginsburg et al., 1990), desde donde se
trasladan por el interior de la expansión del intestino
posterior y mesenterio dorsal hasta llegar a colonizar
las crestas genitales (McLaren, 2003). La migración
es asincrónica siendo las células germinales “pioneras”
llamadas también gonocitos o pre o pro espermatogo-
nias las primeras en salir del intestino posterior, por lo
que llegan más rápido a las crestas genitales y guían a
e inician la formación de la primera espermatogonia
(Manku & Culty, 2015) . El nicho de las células madre
espermatogoniales es el compartimento anatómico que
suministra señales a las mismas controlando su autore-
novación, tasa de proliferación y linaje celular (Ogawa
et al., 2005). Entiéndase que “nicho se reere a un mi-
croambiente especial compuesto por factores de creci-
Palabras claves: Células madre espermatogoniales (SSCs) – células germinales primordiales – cultivo in vitro
Figueroa & Figueroa
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miento incluyendo citocinas que regulan las funciones
de las SSCs que son proveídas por las células de soporte
testicular (Oatley & Brinster, 2012)
Gomperts et al. (1994) sugieren que una interacción
adhesiva entre las células germinales “pioneras” y el te-
jido de las crestas genitales, puede jugar un papel en la
ubicación de las PGCs a medida que se van agregan-
do. Las PGCs, en el alantoides se encuentran en estado
quiescente, y comienzan a proliferar durante la migra-
ción hacia las crestas genitales, entre los 8,5 a 12,5 dpc
en ratón (Phillips et al., 2010). Durante este proceso
migratorio las PGCs sobreviven y proliferan de 100 (8
dpc) a 3000 (12,5 dpc), cantidad que al nal coloniza
la gónada indiferenciada (Bendel-Stenzel et al., 1998),
en humanos la migración ocurre entre la quinta y oc-
tava semana de gestación (Riboldi et al., 1992). Las
PGCs una vez establecidas proliferan, se diferencian en
gonocitos, y se asocian con las precursoras de las célu-
las de Sertoli y células miodes peritubulares (Kolasa et
al., 2012), los gonocitos proliferan por un par de días
y luego se detienen en la fase G0 / G1 del ciclo celular
(g.1). En ratas y ratones los gonocitos reanudan la
proliferación durante la primera semana después del
nacimiento, a la vez que se desplazan de la parte central
a la periferia del túbulo seminífero, donde se estable-
cen como espermatogonias debajo de la supercie de la
membrana basal (Yoshida et al., 2006).
Figura 1. Ciclo del desarrollo de la línea germinal, especicación y aparición de las células PGCs (adaptada de
Mardanpour et al., 2008).
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Mammals spermatogonial cells
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Multiplicación y renovación de las
espermatogonias
En los animales, los tejidos requieren un suministro
continuo de células diferenciadas para realizar sus
funciones. En el testículo de los mamíferos hay una
alta tasa de recambio y diferenciación celular, de
espermatogonias en espermatozoides, durante toda la
vida del individuo (Caires et al., 2010).
Las células madre espermatogoniales (SSCs) son
espermatogonias indiferenciadas que mantienen
el potencial de auto-renovación y la capacidad de
diferenciarse en progenitores determinados, de manera
que aseguran la espermatogénesis (Kanatsu-Shinohara
et al., 2014).
Durante la espermatogénesis en ratones adultos, la
actividad de las células madre reside en un pequeño
conjunto de espermatogonias indiferenciadas (de
Rooij & Russell, 2000), que corresponden a las
siguientes denominaciones: A simple (As), A pareada
(Apr), y espermatogonias A alineadas (Aal), La
espermatogonia As por mitosis origina dos Apr, las que
están conectadas por un puente intercelular (Fig.2).
Estas espermatogonias APr están destinadas para
seguir dividiéndose en cadenas de 4 A-alineada (Aal),
la cadena de espermatogonias alineadas pueden seguir
dividiéndose en cadenas de 8 y 16 espermatogonias
respectivamente (Spradling et al., 2011). Todas las Aal
se diferencian en espermatogonias que después de 6
divisiones mitóticas inician meiosis, espermiogenesis
hasta diferenciarse en espermatozoides. Los puentes de
estas cadenas están conformados por componentes de la
citocinesis y por factores de las células germinales como
TEX 14, una quinasa inactiva esencial para mantener
la estabilidad de los puentes celulares (Greenbaum et
al., 2011).
La espermatogénesis como proceso continuo y
productivo está estrictamente controlada en un
microambiente especial (“nicho”) en los túbulos
seminíferos, donde se encuentran las células de
Sertoli, que interactúan directamente con los SSCs
para controlar su proliferación y diferenciación a
través de la secreción de factores especícos. Las
células de Sertoli también regulan la producción de
espermatocitos meioticos en el lado luminal de la
barrera sangre-testículo a través de señales paracrinas.
Factores de crecimiento de las células de Sertoli como
el factor neurotrópico derivado de las células gliales
(GDNF) se expresa en la supercie de la membrana
de espermatogonias tipo A (Hofmann et al., 2005),
así como el factor de crecimiento del broblasto
(FGF2) entre otros, han sido identicados como los
más importantes que regulan la auto renovación de las
SSCs y la meiosis espermática (Chen & Liu, 2015).
Actualmente también existen marcadores moleculares
que pueden usarse para identicar las SSCs. En ratón
se ha encontrado que el factor de Inhibición de la
Diferenciación 4 (ID4) es un marcador selectivo para
A(s) (Sun et al., 2015) en el testículo de animales
adultos se ha encontrado como marcador de las A(s)
al gen PAX7 (Aloisio et al., 2014) Los genes para
los factores de transcripción PLZF, SALL 4 y el gen
supresor de tumores CDH1, cuya proteína es de
la familia de las cadherinas, se expresan en todas las
espermatogonias indiferenciadas (Suzuki et al., 2009).
Como se puede apreciar la caracterización molecular
de las SSCs, será una herramienta importante para
poder identicarlas, aislarlas y mantenerlas en cultivo
por tiempo prolongado.
Figueroa & Figueroa
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Cultivo in vitro
En los últimos años han sido múltiples los trabajos
que han puesto en evidencia la capacidad de las
espermatogonias en la renovación del epitelio germinal
tanto en modelos de xeno como de homotrasplante
celular (Aguilar et al., 2004).
Los intentos de aislamiento y cultivo in vitro de
SSCs se iniciaron durante la década del 70 (Bellve
et al., 1977), como una fuente promisoria para la
obtención de células pluripotentes, usando estrategias
de enriquecimiento de células madre y de métodos
de cultivo que proporcionen sistemas de ensayo
reproducibles sobre la supervivencia y la replicación in
vitro de las SSCs (Kubota et al., 2004; Baazm et al.,
2013). En este contexto, se ha puesto mucho énfasis
en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro para su
mantenimiento, en estas condiciones, por un tiempo
prolongado. Sin embargo, los esfuerzos realizados hasta
el momento por establecer un protocolo adecuado de
cultivo in vitro, han sido obstaculizado, primero por
la falta de marcadores especícos para la identicación
de las células madre espermatogoniales, y, en
segundo lugar, el conocimiento limitado de factores
nutricionales y de crecimiento requeridos (Hofmann
et al., 2005; Hermann et al., 2011; Costa et al., 2012;
Bellaiche et al., 2014).
Para estudiar la dinámica proliferativa de
espermatogonias in vitro, se ha utilizado fragmentos de
testículo de ratones de nueve días de nacidos (Boitani
et al., 1993) y el cultivo de suspensiones de células
aisladas (Tres & Kierszenbaum, 1993). De estos dos
sistemas, el cultivo de suspensiones de células aisladas
es el que más se viene utilizando. Actualmente se cuenta
con diferentes protocolos experimentales para aislar
y mantener en cultivo in vitro colonias de SSCs en
diferentes especies. En el aislamiento y enriquecimiento
de células madre espermatogoniales, se utilizan
marcadores de expresión como y-1 y ERF-1 y de
ausencia como c-kit (Shinohara et al., 1999; Barros
Figura 2. Modelo de la línea germinal en ratón (adaptado de Spradling et al., 2011).
ESPERMATOGONIAS
ESPERMATOCITO
ESPERMATIDA
ESPERMATOZOIDE
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et al., 2012) principalmente, en las espermatogonias
tipo A se expresan, además, los receptores para GDNF
(Dettin et al., 2003; von Schonfeldt et al., 2004).
Los primeros intentos de aislamiento de SSCs
consistieron en separar las espermatogonias tipo A por
digestión enzimática de tejido testicular (Izadyar et al.,
2002). Este protocolo inicial se ha venido combinando
con diferentes técnicas, entre las cuales encontramos
el uso de gradiente de densidad discontinua (van Pelt
et al., 1996), como una de ellas. Precisamente usando
el gradiente de densidad discontinua en testículos de
perro doméstico, en nuestro laboratorio, se obtuvo
un poco más de 93% células recuperadas, las células
de ambas interfases de Percoll (45-60% y 30-45%)
tuvieron actividad de fosfatasa alcalina en los dos
métodos utilizados: el no enzimático y el enzimático.
Se observó, además, que aquellas células aisladas por
el método no enzimático son las que generan mayor
número de colonias, pero no resisten a más de 3
pases o sub cultivos mientras que las células aisladas
por el método enzimático resisten hasta 7 pases, pero
forman un menor número de colonias. En gradiente
discontinuo de Percoll también se recuperaron SCCs de
los túbulos seminíferos de testículos de bovinos (Barros
et al., 2012), si bien este método permite recuperar
un porcentaje relativamente alto de células madre
espermatogoniales, en el caso de los bovinos no fue el
más adecuado para puricar completamente las SCCs,
sobre todo la que expresan el marcador a-6 integrina.
Perspectivas
Las células madre espermatogoniales son responsables
de la transmisión de la información genética de un
individuo a su generación siguiente ya que a través del
proceso espermatogenico, se asegura la continuidad de
una especie. (Aguilar et al., 2004). Si bien es cierto que
en el nicho testicular estas células solo se diferencian a
espermatozoides, cuando son aisladas y cultivadas in
vitro en ambientes adecuados, adquieren o maniestan
pluripotencia y se diferencian a tejidos provenientes
de las tres capas gemínales (Golestaneh et al., 2009).
Una simple SSC puede adquirir pluripotencia, sin
embargo, la conversión a un tipo celular pluripotente
está acompañada por la pérdida del potencial
espermatogénico (Kanatsu-Shinohara et al., 2014),
además Ning et al. (2010) demostraron que las SSCs
de ratón se transdiferencian a células hematopoyéticas
viables morfológica y funcionalmente. Actualmente
existen numerosas evidencias que demuestran que
diversos tipos de células pluripotentes han sido
generados y derivados de la línea células madre
germinales- derivadas a células madre pluripotentes
(GPSCs) en cultivo in vitro de testículos de ratón y
de humano (Sungtae & Belmonte, 2011), las GPSCs
también pueden diferenciarse a hepatocitos funcionales
in vitro (Fagoonee et al., 2010), razones sucientes para
entender el gran potencial que tienen las GPSCs en la
medicina regenerativa.
Por otro lado, la posibilidad de producir
espermatozoides in vitro a partir de una GPSC tiene
grandes alcances para la industria agropecuaria,
en la restauración de la fecundidad humana, en la
preservación de especies en peligro de extinción y varias
otras tecnologías relacionadas con la reproducción de
mamíferos. En algunos casos de infertilidad humana,
sería suciente tener un espermatozoide originado
de una GPSC para producir descendencia a través
de tecnologías de reproducción asistida (ARTs). Se
podría establecer sistemas de cultivo de SSCs autólogas
para individuos antes de tratamientos oncológicos
y los espermatozoides generados in vitro podrían ser
crioconservados para uso posterior y de esta manera
garantizar la descendencia en estos pacientes. Además,
estas técnicas también podrían proporcionar medios
para preservar especies amenazadas, por ejemplo,
poblaciones animales con muy pocos individuos que al
momento de morir podrían tener sus SSCs recolectadas
para que los espermatozoides se produzcan en el
laboratorio (Aponte, 2015).
Las biotecnologías del SSCs requieren conocimientos
especícos de las condiciones de cultivo in vitro, así
como las técnicas de trasplante, y crioconservación
dos aspectos a los que nos referiremos en esta mini
revisión que de alguna manera resume el enfoque
biotecnológico asociado al uso de las SSCs.
El trasplante de SSCs es una herramienta importante
para otras aplicaciones biotecnológicas como la
terapia génica o la restauración de la fecundidad.
Esta técnica se inicia con los trabajos de Brinster
& Zimmermann (1994) quienes lograron aislar
células espermatogoniales de un testículo de ratón y
transferirlas a los túbulos seminíferos de otro testículo
estéril, donde la espermatogénesis ocurrió de manera
normal dando lugar a espermatozoides viables. Un
análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad de las
células madre (Ryu et al., 2005) se puede comprobar
con los resultados del trasplante de SSCs de ratones
Figueroa & Figueroa
239
fértiles a los túbulos seminíferos de ratones infértiles
que dio lugar a una progenie con haplotipo derivado
del donante, en este proceso las células del donante
colonizan el nicho receptor, que implica la migración
a la ubicación y la supervivencia apropiada, por lo
que es importante determinar los factores necesarios
para aumentar la proliferación y diferenciación de las
colonias de células germinales donantes en testículos
del receptor, por ejemplo trasplantar células germinales
de primates a testículo de ratón (Nagano et al., 2001).
El análisis funcional de las SSCs consiste en un ensayo
retrospectivo de la función espermatogénica. Las
células son aisladas de los túbulos seminíferos del
donador y trasplantadas a los túbulos seminíferos del
receptor infértil, donde producen colonias normales
de espermatogénesis y espermatozoides funcionales
(Phillips et al., 2010). La crioconservación es otra
tecnología cuyos métodos deben optimizarse para
incrementar la tasa de supervivencia de las SSCs
después de la descongelación (Aliakbari et al., 2016).
Estudios iniciales de Avarbock et al. (1996), usando
técnicas similares para crioconservar células somáticas,
demostraron que la criconservación de SSCs es factible
de realizarse. Las SSCs descongeladas trasplantadas a
túbulos seminíferos de ratones estériles, hicieron que
recuperen su capacidad fértil.
Sin embargo, no existen estudios relacionados a la
evaluación de la eciencia, de la crioconservación de
SSCs con una mayor tasa de supervivencia, pero si
existen algunos reportes donde se evalúan directamente
los efectos de la crioconservación sobre las SSCs, asi
como estudios relacionados con la criconservación
de tejido testicular para la extracción posterior de
SSCs (Keros et al., 2007). Diversos estudios han
demostrado que suspensiones de las SSCs de ratón,
rata, conejo y babuino son capaces de sobrevivir
después de permanecer por tiempo prolongado (12-
14 años) en congelación. Las células de testículo de
ratón y rata reinician la espermatogénesis en testículos
receptores y pueden generar progenie normal y fértil
sin errores genéticos o epigenéticos evidentes (Wu et
al., 2012). Así mismo poblaciones adultas y fetales
SSEA-4 humanas mostraron diferente sensibilidad a
la crioconservación, si habían sido congeladas in situ
como tejidos testiculares o como suspensiones celulares
(Yango et al., 2014).
Diversos estudios han demostrado que sustancias como
el glicerol, el dimetil sulfoxido (DMSO), el etileno
glicol (EG) o el polietileno glicol (PE) son sustancias
criprotectoras efectivas para la crioconservación
de células y tejidos, pero su efectividad es variable
para diferentes poblaciones de células testiculares.
Se ha demostrado que la tasa de supervivencia post
congelación y la estructura de los túbulos seminíferos
se ven afectadas por el tipo de crioprotectores así como
por las tasas de congelación (Milazzo et al., 2008).
Existentes criterios diferentes en el uso de estos agentes
crioprotectores, algunos consideran que los tejidos
testiculares de hombre o de murinos se crioconservar
mejor cuando se usa DMSO (Wyns et al., 2008), otros
consideran que el EG es más efectivo para mantener
las espermatogonias en tejido testicular inmaduro
humano (Kvist et al., 2006) o que el PEG (2,5%) es el
agente más eciente para la crioconservacion de SSCs
(Yong-An et al., 2013).
Esta ampliamente aceptado que las células germinales
primordiales humanas y las células madre de la línea
germinal neonatal y adulta de ratón son pluripotentes
y muestran propiedades similares a las células madre
embrionarias (Conrad et al., 2008).
Es probable que estas técnicas sean aplicables a muchas
especies, ya que las células de testículo de rata pueden
ser crioconservadas y generar espermatogénesis en los
túbulos seminíferos de ratones inmunodecientes.
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Received March 1, 2017.
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