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ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2020, 17(1), jan-jul.: 97-125.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
TOXICITY OF THE BINARY MIXTURE OF METOMYL AND ROTENONE
PESTICIDES ON DUCKWEED LEMNA MINOR (LINNAEUS, 1758)
TOXICIDAD D
E LA MEZCLA BINARIA DE LOS PLAGUICIDAS METOMILO
Y ROTENONA EN LA LENTEJA DE AGUA LEMNA MINOR (LINNAEUS, 1758)
Eduardo Alejandro Hidalgo-Nicho1 & José Iannacone1,2,*
1 Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.Lima, Perú.
2 Escuela Universitaria de Postgrado. Grupo de Investigación Sostenibilidad Ambiental (GISA). Facultad de Ciencias
Naturales y Matemática (FCCNM), Laboratorio de Ecología y Biodiversidad Animal (LEBA), Universidad Nacional
Federico Villarreal (UNFV). Lima, Perú.
*Corresponding author: joseiannacone@gmail.com
ABSTRACT
Macrophyte Lemna minor (Linnaeus, 1753) was used to evaluate the phytotoxicity of the individual and mixed action of
methomyl and rotenone pesticides under laboratory conditions (Temperature 29 ± 2°C; Relative humidity 48.6± 9.4%).
e taken measures to establish half e ective concentration were the frond area (AF) and production of new fronds (NF).
In this study, BMDS® and Probit statistical data analyses were used to compare the results about e ective concentration.
Results suggest Benchmark dose method of BMDS® program was more e ective than Probit program when EC50 (mean
E ective Concentration) were determined. Additionally, total chlorophyll concentration (TCC) and humidity weight
(HW) parameters were calculated to determine the growth inhibition (Ir). Likewise, NOAEL (no observed adverse
e ect level) and LOAEL (low observer adverse e ect level) were compared with BMDL (lower bench mark dose) and
BMD (Bench mark dose), respectively. BMD and BMDL values were more accurate than NOAEL and LOAEL values.
Phytotoxic action varied according the parameter. EC50 values of L. minor showed poor sensibility to methomyl pesticide
with an elevated concentration in both parameters (6919.79 mg·L-1 and 7147.42 mg·L-1 for AF and NF, respectively).
Results of rotenone pesticide were lower than methomyl, with 1079.22 mg·L-1 (NF) and 782.17 mg·L-1 (AF). Finally,
the mix toxicity was 597.90 mg·L-1 (methomyl: NF), 298.93 mg·L-1 (rotenone: NF), 629.51 mg·L-1 (methomyl: AF)
and 314.75 mg·L-1 (rotenone: AF). Finally, the concentration-addition model showed that the phytotoxic action of the
mixture of both pesticides in L. minor has a synergistic e ect.
Keywords: Binary toxicity – BMD – BMDL – EC50 – individual toxicity – Lemna minor – methomyl – rotenone
RESUMEN
Se evaluó la toxicidad individual y binaria de los plaguicidas metomilo y rotenona en la macro ta Lemna minor
(Linnaeus, 1753) para determinar la acción sinérgica o antagónica de una mezcla equitóxica. Los ensayos se realizaron
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v17i1.3058
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bajo condiciones de laboratorio (Temperatura: 29 ± 2°C; Humedad relativa: 48,6 ± 9,4 %) y los resultados fueron
analizados con los programas estadísticos BMDS® y Probit para calcular la concentración efectiva media (CE50) a través
de los parámetros Área de la Fronda (AF) y Nuevas Frondas (NF). Los resultados sugieren una mayor precisión al utilizar
el Método del Punto de Referencia del programa BMDS® para el cálculo de la concentración efectiva. Adicionalmente,
se calculó la concentración total de clorola (CTC) y peso húmedo (PH) para determinar la inhibición del crecimiento
(Ir). Del mismo modo, se realizó una comparación entre los valores NOAEL (nivel de efecto no observado) y LOAEL
(nivel bajo de efecto observado) versus los valores de BMDL (límite inferior del punto de referencia) y BMD (nivel de
variación en el punto de referencia), respectivamente. El análisis muestra que existe una mayor precisión al emplear los
valores BMD y BMDL. La acción totóxica varió según el parámetro analizado. La CE50 mostró mayores valores en el
parámetro NF (1079,22 mg·L-1 para rotenona; 7147,42 mg·L-1 para metomilo; 597,904 mg·L-1 mezcla binaria: metomilo
y 298,93 mg·L-1 mezcla binaria: rotenona) que en el parámetro AF (782,17 mg·L-1 para rotenona; 6919,79 mg·L-1 para
metomilo; 629,51 mg·L-1 mezcla binaria: metomilo y 314,75 mg·L-1 mezcla binaria: rotenona). Finalmente, el modelo
de concentración-adición mostró que la acción totóxica de la mezcla de ambos plaguicidas en L. minor tiene un efecto
sinérgico.
Palabras clave: BMD – BMDL – CE50 – Lemna minor – metomilo – rotenona – toxicidad binaria – toxicidad individual
INTRODUCCIÓN
Los plaguicidas tienen un rol protagónico dentro de la
agricultura peruana a pesar de los avances tecnológicos para
mejorar la tecnología agrícola (Velazco & Velazco, 2012).
Debido a ello, se ha ido regulando la comercialización
de diversos plaguicidas para evitar que su empleo cause
daños a la salud y el ambiente (Yanggen et al., 2003;
Iannacone & Alvariño, 2005; Park et al., 2017; Zhou et
al., 2020), estableciendo las concentraciones que generan
efectos mínimos y letales en diversos organismos a través
de ensayos ecotoxicológicos (SENASA, 2014; Tagun &
Boxall, 2018). No obstante, poco se ha estudiado sobre el
uso de la acción combinada de los plaguicidas, y por ende
es fragmentada (Iannacone et al., 2011; Tagun & Boxall,
2018; Kostopoulou et al., 2020).
Dentro de los plaguicidas con mayor uso en el Perú se
encuentran el metomilo y la rotenona, ambos utilizados
para un amplio rango de plagas agrícolas. La rotenona, al
ser de origen vegetal, tiene la ventaja de ser biodegradable
y no producir desequilibrio en el ecosistema por lo que
provoca un impacto mínimo sobre la fauna benéca
(Iannacone & Lamas, 2003; Wu et al., 2020). En cambio,
el metomilo puede tener una vida media persistente si se
presentan las condiciones ideales en el suelo, pudiendo
llegar hasta los cincuenta días (Iannacone & Alvariño,
2008; Napán et al., 2010; Van Scoy et al., 2013; Iannacone
et al., 2014). Si bien se conoce el efecto que produce cada
plaguicida de manera individual en diversos organismos,
aún no existen estudios que registren el efecto de la acción
combinada de ambos plaguicidas en plagas y organismos
no destinatarios (Iannacone et al., 2011).
El uso de plantas en ensayos de toxicidad permiten la
investigación, detección y cuanticación del tóxico activo
en el medio natural (Radić et al., 2010; Park et al., 2017;
Zhou et al., 2020), siendo la Lemna frecuentemente
utilizada para realizar ensayos toxicológicos de muchas
sustancias debido a su pequeño tamaño, rápido crecimiento
y por su alta sensibilidad a varios contaminantes (Swanson
et al., 1991; Park et al., 2017; Kostopoulou et al., 2020),
evitando así el uso indiscriminado de los plaguicidas. La
lenteja de agua Lemna minor (Linnaeus, 1758), es una
monocotiledónea acuática que a menudo ota en las
supercies de los cuerpos de agua, de rápido crecimiento
y se utiliza habitualmente para establecer la calidad de
los cuerpos de agua a través del monitoreo de metales
pesados o de otros contaminantes acuáticos (Khellaf &
Zerdaoui, 2010; Park et al., 2017; Martinez et al., 2019;
Dias de Alkimin et al., 2020; Martinez et al., 2020; Zhou
et al., 2020).
La cuanticación de los efectos totóxicos generados
por la interacción de un determinado plaguicida con L.
minor permite establecer el porcentaje de inhibición del
crecimiento, la concentración efectiva al 10% (CE10), la
concentración efectiva media (CE50) (Tagun & Boxall,
2018), el nivel con un menor efecto observado (LOAEL) y
la ausencia del efecto observado (NOAEL). No obstante,
en el presente estudio se ha incluido al método del punto
de referencia (Benchmark dose – BMD) para el cálculo
Pesticides on duckweed
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de la concentración efectiva media y los equivalentes del
NOAEL y LOAEL (BMD y BMDL, respectivamente).
La ventaja de este método radica en que su valor no
depende de las dosis trabajadas, siendo más especícos
para el cálculo de aquellas concentraciones que mostrarán
un bajo nivel de efecto tóxico.
En el presente trabajo, evaluó la toxicidad de la mezcla
binaria de los plaguicidas metomilo y rotenona en L. minor.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de ejecución: El presente trabajo de investigación
se realizó en la Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Ricardo Palma (URP), Santiago de Surco,
Lima, Perú (12°8’1,42’’LS y 76°58’49,31’’LW).
Plaguicidas empleados para el estudio: Se emplearon dos
productos sintéticos formulados metomilo (Lannate® 90:
900g.L-1) obtenido de la casa comercial “Agroinversiones
Señor de Muruhuay” y rotenona (Rotebiol
®
: 100,3 mg
.
L
-1
)
o
btenido de la casa comercial “Agro Alvino E.I.R.L.”
Organismo bioindicador: Lemna minor se obtuvo de un
acuario del centro de la ciudad de Lima. Para su identi-
cación se utilizó la clave taxonómica propuesta por Daubs
(1965). Adicionalmente, dicha clave se complementó con
el trabajo de Suman & Venu (2012).
Condiciones físicas del ensayo: Se utilizó una cámara de
cultivo para reducir el grado de contaminación y man-
tener una temperatura y humedad estable. En la parte
superior de la cámara, se ubicaron tres tubos uorescen-
tes de la marca GE Lighting® USA, cada uno con una
luminiscencia de 40 Watts con la nalidad de proveer
una iluminación vertical continua, con un fotoperiodo de
24: 0 h. Para determinar la luminosidad en lux, se utilizó
el Software LoggerPro® Versión 3.2.1 en Español junto al
sensor de luz y la interfase proporcionados por el Labo-
ratorio de Física Intermedia de la Facultad de Ingeniería
de la URP. Se realizaron las pruebas con los tres tubos
uorescentes para determinar la distancia, con un tiempo
de 10 min por cada ensayo. El promedio de los datos
obtenidos (3 datos por seg) a una distancia de 25 cm fue
de 3556,50 lux.
Acondicionamiento: Semanas antes al inicio de los ensa-
yos se seleccionaron aquellas colonias de L. minor que no
presentaron daños visibles en sus frondas, siendo esteri-
lizadas según el protocolo sugerido por OECD (2006).
Cada colonia se sumergió en una solución de Hipoclo-
rito de sodio al 0,5% (v:v) por al menos un min. Una
vez nalizado el tratamiento, se lavaron las frondas con
abundante agua destilada estéril y se repitió el procedi-
miento. Finalizada la esterilización, las colonias se colo-
caron en 400 mL de solución hidropónica La Molina®, la
cual contiene una solución de macro nutrientes y micro
nutrientes (tabla 1). Adicionalmente se añadió 0,5 mL
del fertilizante Byfolan Forte® para asegurar que el cultivo
posea todos los nutrientes minerales esenciales (tabla 2).
Tabla 1. Concentración en 1L de solución de los minerales en la Solución Hidropónica La Molina℗.
Minerales Concentración (%) Minerales ppm
(mg/L)
Solución A (macronutrientes)
Nitrato de Potasio 2,2 K 210
Nitrato de Amonio 1,4 N 190
Superfosfato triple 0,72 Ca 150
Solución B (micronutrientes) S 70
Sulfato de Magnesio 5,5 Mg 45
Quelato de Hierro 6% Fe 0,425 P 35
Solución de micronutrientes 10 Fe 1
Sulfato de Manganeso 0,05 Mn 0,5
Ácido Bórico 0,003 B 0,5
Sulfato de Zinc 0,0017 Zn 0,15
Sulfato de Cobre 0,001 Cu 0,1
Molibdato de Amonio 0,0002 Mo 0,05
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Tabla 2. Concentración en 1L de solución de los minerales en el fertilizante Byfolan Forte®.
Ingrediente Concentración (%)
Nitrógeno total 11,470
Fósforo como P2O38,000
Azufre 6,000
Boro 0,230
Calcio 0,036
Cobre 0,025
Cobalto 0,040
Fierro 0,002
Manganeso 0,050
Molibdeno 0,005
Magnesio 0,025
Zinc 0,080
Ácido indolacético 0,003
Clorhidrato de tiamina 0,004
El medio se repuso al cabo de una semana de cultivo;
además, se cubrió la supercie de los vasos con un
tapón de algodón para evitar la evaporación y facilitar el
intercambio gaseoso. Siguiendo el protocolo de la OECD
(2006), las plantas se mantuvieron durante un mínimo
de ocho semanas con la solución hidropónica y el agua
de mesa Cielo® (tabla 3) para asegurar la depuración de
todos los posibles residuos del lugar de origen.
Tabla 3. Análisis de los parámetros sicoquímicos del agua de mesa embotellada con una
sonda multiparámetro (Hanna HI9828).
Parámetro Unidad Medición
Oxígeno disuelto DO mg·L-1 4,05
Porcentaje de saturación DO DO% 46,9
pH - 6,97
Salinidad ppm 0,3
Ensayos: Un día antes de iniciar cada ensayo se seleccio-
naron 118 colonias sin lesiones visibles o cambios de co-
lor. Estas se depositaron en una vaso de precipitado con
300 mL de agua destilada estéril (pH = 6,6) sin solución
hidropónica. Se realizaron un total de cuatro ensayos de
toxicidad aguda individual (dos de metomilo y dos de
rotenona) con modicaciones del protocolo de la OECD
(2006). Dichos ensayos variaron en el tipo de agua utili-
zada; los dos primeros ensayos de metomilo y rotenona se
realizaron con agua destilada y los otros dos con el agua
de mesa Cielo®.
Para cada ensayo se realizaron seis repeticiones por trata-
miento, siendo el número inicial de colonias de 3 ejem-
plares (3 a 4 frondas por ejemplar). Asimismo, las unida-
des del ensayo se colocaron en un beaker BOECO® de 50
mL por un periodo de 168 h, con lecturas a los cuatro
(96 h) y siete días (168 h). Luego de cumplido el tiem-
po de exposición, las muestras fueron procesadas para su
posterior análisis. Se empleó el tratamiento control (sin
el tóxico) para comparar los resultados. Debido a la na-
turaleza de los insecticidas a emplear, el tipo de ensayo
fue con reposición del medio de cultivo a cuatro días de
iniciado el ensayo. Las colonias se expusieron a diferen-
tes concentraciones de los tóxicos escogidos durante siete
días sin aireación y con iluminación vertical continua (24
h; luz articial).
Toxicidad aguda individual: La actividad tóxica del
metomilo y la rotenona, se analizaron empleando cinco
Pesticides on duckweed
101
concentraciones más un control negativo por cada tóx-
ico. Los productos fueron dosicados de acuerdo a las
recomendaciones comerciales. Para el caso del metomilo,
se preparó un stock de concentración distinto por cada
ensayo realizado. La concentración máxima del primer
ensayo con metomilo fue de 2000 mg·L-1, realizando las
siguientes diluciones: 400 mg·L-1, 80 mg·L-1, 16 mg·L-1 y
2 mg·L-1. El factor de dilución fue de 0,2. En el segundo
ensayo con metomilo se utilizó las concentraciones em-
pleadas por Iannacone & Alvariño (2008), preparando
una solución stock de 2000 mg·L-1 en 500 mL realizando
las siguientes diluciones: 4000 mg·L-1, 2000 mg·L-1, 1000
mg·L-1; 500 mg·L-1 y 250 mg·L-1. El factor de dilución
empleado fue de 0,5.
Para el caso de la rotenona, en ambos ensayos se efectuaron
las siguientes diluciones: 2000 mg·L-1, 1000 mg·L-1, 500
mg·L-1, 250 mg·L-1 y 125 mg·L-1. Por cada ensayo, se
realizaron lecturas a las 96 h y 168 h. El factor de dilución
utilizado fue de 0,5. El presente estudio sólo consideró el
análisis de los resultados de un ensayo por cada plaguicida.
En el caso del metomilo se analizó el ensayo realizado con
agua
Cielo
®
y en el caso de la rotenona el ensayo realizado
con agua destilada.
Toxicidad aguda binaria: Se preparó una solución
madre con 4000 mg·L
-1
de metomilo y 2000 mg·L
-1
de rotenona en agua de mesa C
ielo
®
, considerándola
como la proporción de 1:1. La evaluación de la mezcla
equitóxica se realizó en cuatro diluciones seriadas al
50%, 25%, 12,5% y 6,
25% más un control negativo.
Asimismo, se estable
cieron lecturas a las 96 h y 168 h.
Las concentraciones utilizadas en el ensayo de toxicidad
fueron las señaladas en la Tabla 4.
Tabla 4. Concentraciones empleadas para el ensayo de la
mezcla binaria equitóxica (mg·L-1) en Lemna minor.
Concentración Metomilo Rotenona
Control 0 0
R1250 125
R2500 250
R31000 500
R42000 1000
R54000 2000
Análisis de los datos
Número de frondas (NF): Se utilizó el registro fotográf-
ico para el conteo de las frondas durante el inicio del
ensayo, así como la lectura durante el ensayo (96 h) y
la lectura nal del ensayo (168 h). El mismo método se
utilizó para la determinación de la clorosis (frondas se tor-
nan amarillas) y la necrosis (presencia de tejido muerto en
la fronda y borde irregular), supeditando la presencia de
estos signos de totoxicidad cuando al menos la mitad de
la fronda presentaba dichas características. Asimismo, se
utilizó el protocolo de la OECD (2006) para la determi-
nación de la tasa de producción de nuevas frondas (µ) y la
inhibición del crecimiento (Ir).
Fórmula para la determinación de µ:
µi-j = In (Nj) - In (Nj)
tj - ti
(1)
Donde:
µi-j : Promedio de crecimiento especíco de un momento
i a un momento j.
Ni: Número de frondas observadas en el ensayo o prueba
control en el tiempo i.
Nj: Número de frondas observadas en el ensayo o prueba
control en el tiempo j.
ti: Momento en el que inicia el ensayo.
tj: Momento en el que naliza el ensayo.
Fórmula para la determinación de Ir:
%Ir = µc - µr x 100
µc
(2)
Donde:
% Ir: Porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento
promedio.
µc: Valor promedio de µ en el control.
µr: Valor promedio de µ en el grupo de tratamiento.
Área de la fronda (AF): El registro fotográco se realizó
en las lecturas de todos los ensayos utilizando una
cámara compacta Canon® SX700HS. El área total de
cada ensayo (Tagun & Boxall, 2018), así como el área
de la necrosis y la clorosis, se determinó con el software
de distribución gratuita ImageJ® (g. 1), desarrollado
por el Research Services Branch, del National Institute
of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA. También
se utilizaron las fórmulas (1) y (2). Las colonias se
recolectaron inmediatamente después de la segunda
lectura y se formaron dos grupos por cada concentración
(tres unidades de ensayo en cada grupo). Con el primer
grupo se determinó el peso seco y con el segundo grupo
se calculó el contenido total de clorola. Cada unidad
de ensayo fue centrifugada de manera individual a 3000
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rpm x 10 min en tubos eppendorf de 5 mL (Centrífuga
Heraeus Labofuge 200®), a los cuales se les hizo un agujero
en la parte inferior para descartar el exceso de agua. Luego,
se utilizó una balanza analítica (Alexander MφBBA
®
)
para calcular el peso fresco de cada concentración. Cabe
señalar que en los ensayos de toxicidad individual donde
se utilizó agua destilada, este procedimiento se realizó por
cada grupo y no por cada unidad de ensayo.
Figura 1. Detección de área total y necrosis en Lemna minor. Ensayo metomilo (agua
Cielo®); lectura 96 h; 4000 mg·L-1 [2]. A: Imagen original con una tira de papel de 10 mm; B:
frondas aisladas; C: cálculo del área total y D: cálculo de la necrosis.
10 mm
A
1 mm
1 mm
1 mm
D
C
B
Peso húmedo (PH): Se colocaron todas las muestras del
primer grupo en una estufa (ermo Electron Corpora-
tion®) durante 24 h a 43°C para posteriormente determi-
nar el peso seco.
Contenido Total de Clorola (CTC): La prueba del con-
tenido total de clorola se realizó una vez determinado el
peso fresco del segundo grupo. Para esta prueba, las mues-
tras fueron sumergidas en metanol en tubos herméticos de
2 mL; posteriormente, fueron cubiertas con papel platino
y guardadas durante 96 h en un ambiente frio. Finalizado
el tiempo
de extracción de la clorola, se midió la absor-
bancia a 635 nm y 660 nm (con un espectofotómetro
Mer
ck SQ118®). Para calcular el contenido total de cloro-
la a (Cchl a) y clorola b (Cchl b), se modicó la absor-
bancia en la fórmula mencionada por Valenzuela (2013):
Cchl a = 12,63 x A664,5 – 2,52 x A647
Cchl b = 20,47x A647 – 4,73 x A664,5
Cchl total = 17,95 x A647 + 7,90 A664,5
Determinación de BMDL y BMD: En el presente
estudio se optó por utilizar el método Benchmark dose
(punto de referencia), empleando el paquete estadístico
BMDS
®
versión 2,6 elaborado por la Agencia de Protección
Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, 2015). Este
método, reemplaza los valores de NOAEL (nivel de efecto
no observado) y LOAEL (nivel con bajos efectos adversos)
por el BMDL (nivel inferior al punto de referencia) y el
BMD (punto de referencia), respectivamente. Cabe señalar
que los valores de NOAEL y LOAEL son ampliamente
utilizados en la toxicología. No obstante, el modelo BMD
supera las limitaciones que implican el uso del NOAEL,
tales como la dependencia estricta en la selección de
concentraciones y el tamaño de la muestra de estudio a
partir del cual se identica el efecto crítico.
Para la determinación del BMDL y el BMD de las pruebas
evaluadas, se utilizó el modelo dicotómico, el cual es
utilizado para describir dos niveles de respuesta, usualmente
categorizados como presencia o ausencia (ej. frondas vivas
y frondas muertas). Para el análisis de los datos, se utilizó
la necrosis como valor de respuesta frente a los parámetros
de NF y AF. En el caso de NF se consideró como fronda
necrótica a aquella hoja que presentaba más de la mitad
del tejido muerto mientras que en el parámetro de AF
se consideró como necrosis a toda el área de la fronda
que presentó tejido muerto. En algunos casos, el análisis
computarizado de las imágenes no permitió la detección del
área necrótica, optándose por la selección manual del área.
El modelo dicotómico presenta nueve variaciones del
Pesticides on duckweed
103
mismo, las cuales ayudan a representar el amplio rango de
la curva de la dosis-respuesta de un determinado tóxico. Se
emplearon ocho de estas variaciones, escogiendo aquella
que presentó un valor de p más signicativo. Además,
se optó por analizar la suma de las respuestas de todos
los ensayos por cada concentración, considerando como
respuesta a la cantidad de frondas necróticas (parámetro
NF) y el área total necrosada (parámetro AF).
Determinación de la Concentración Efectiva Media
(CE50): Para la determinación de la CE50 individual de
cada tóxico y de la mezcla binaria, se empleó el programa
computarizado Probit versión 1,5 (ron et al., 1995).
Luego, el resultado fue contrastado con el método del
BMD a través del programa estadístico BMDS® para
establecer su efectividad en el cálculo de la concentración
efectiva al 10% y 50% (CE10 y CE50, respectivamente).
Para hallar la CE50 con el modelo BMD, se modicó
el valor de respuesta al 50%. Por defecto, este valor es
equivalente al 10% del efecto observado (CE10).
Determinación del efecto sinérgico o antagónico: Se deter-
minó el valor de Concentración-Adición (CA) para el ensayo
de toxicidad binaria (Martínez et al., 2019). En la Concen-
tración-Adición se asume que, cuando dos tóxicos actúan de
modo similar siendo mezclados en cualquier proporción, ellos
se sumarán para dar la respuesta observada (Gaete & Chávez,
2008). El valor de CE50 estimada se obtiene sumando los va-
lores de CE50 de los tóxicos obtenidos experimentalmente de
forma individual según su contribución en la mezcla de acuer-
do a las proporciones probadas. Luego, estos valores de CE50
estimadas son divididos por los valores obtenidos experimen-
talmente de la mezcla binaria, para así determinar la clase de
acción conjunta de acuerdo con la siguiente ecuación:
CA = CE50 estimada /CE50 experimental de la mezcla
Donde CA = 1 indica que el efecto es aditivo, CA > 1 que
hay sinergia y que CA < 1 que hay antagonismo.
Validación de los ensayos: Como primer criterio para la
validación de los ensayos de toxicidad individual se utili-
zó el paquete estadístico SPSS versión 22 para Windows
7. De este modo, se calculó la homogeneidad de los pará-
metros evaluados mediante el factor ANOVA y a un nivel
de signicancia de p ≤ 0,05. Los parámetros evaluados
para este análisis estadístico fueron la producción de NF,
la totalidad de frondas necróticas y cloróticas, el AF y el
área necrótica y clorótica. Asimismo, se utilizó el paráme-
tro de CTC como un factor determinante para la elección
de los ensayos analizados de toxicidad individual.
RESULTADOS
Determinación taxonómica de Lemna minor
Las colonias utilizadas para el presente estudio presentan
frondas planas, elípticas, ligeramente asimétricas, con
el ápice redondeado, un nervio central y cámaras de
aerénquima pequeñas y no prominentes. El color verde del
envés es más claro que en el haz. Asimismo, se evidencia
una sola raíz (talo) por fronda madre, sin escamillas dorsales
o ventrales y con una vaina alada (caliptra) en la base de la
misma. Las medidas de las frondas se ubican dentro del
rango establecido para esta especie (1,5 – 5 x 1 – 3,32 mm),
lo mismo que con el talo (hasta 6,2 mm) y la caliptra (0,5
– 3,1 mm). (Fig.2)
Figura 2. Lemna minor L. A. Vista del haz. Medida de la raíz: 6,13 mm; caliptra: 0,994 mm B. Medida transversal:
b.1) 1,79 mm; b.2) 2,86 mm y b.3) 1,40 mm. Medida longitudinal: b.1) 2,06 mm; b.2) 2,33 mm y b.3) 1,87 mm.
C. Vista
del envés. Cámaras de aerénquima no prominentes.
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Validación de los ensayos
Con el análisis mediante ANOVA se obtuvo un nivel
de
signicancia menor a 0,05 para las pruebas de homogeneidad
de varianzas en todos los parámetros evaluados en los
ensayos donde se utilizó agua Cielo®
(tabla 5).
Tabla 5. Nivel de signicancia en la prueba de homogeneidad de las varianzas en Lemna minor.
Parámetros evaluados Metomilo Rotenona
AD AC AD AC
número de frondas (NF) 0,02 0,00 0,00 0,00
frondas con necrosis 0,00 0,00 0,40 0,00
frondas con clorosis 0,05 0,00 0,00 0,00
área total (AF) 0,41 0,00 0,03 0,01
área con necrosis 0,00 0,00 0,15 0,00
área con clorosis 0,00 0,00 0,00 0,00
AD: Agua destilada; AC: Agua Cielo®
No obstante, para el caso de la rotenona se decidió
emplear la data generada en el ensayo AD puesto que,
cuando se empleó la data obtenida con el ensayo AC, no
se pudo realizar el análisis respectivo debido a la ausencia
de una relación entre el tóxico y los parámetros evaluados
(tabla 6).
Tabla 6. Número de frondas y área total (mm2) en Lemna minor sometida a dos ensayos de toxici-
dad individual según el tipo de agua empleada (día 7: lectura 168 h).
Metomilo Rotenona
AD AC AD AC
NF AF NF AF NF AF NF AF
control 210 387,15 285 702,63 165 275,49 307 681,90
A 199 384,54 229 524,39 114 200,57 139 262,96
B 162 304,18 203 419,82 123 197,17 127 255,26
C 175 322,22 149 287,25 100 160,08 128 244,56
D 146 235,05 139 254,30 59 117,47 123 233,90
E 83 158,32 72 162,70 56 111,27 128 242,24
AD: agua destilada y AC: Agua Cielo®; NF: número de frondas y AF: área de la fronda. A a E: Concentraciones según plaguicida empleado.
Por otro lado, también se consideró el porcentaje de
inhibición del parámetro de clorola (CTC) para
determinar la validez del ensayo. Dicho parámetro fue
uno de los factores determinantes para la elección de los
dos ensayos de toxicidad individual analizados (tabla 7).
Tabla 7. Porcentaje de inhibición del crecimiento (%Ir) en Lemna minor según el parámetro con-
tenido total de clorola (CTC) en cuatro ensayos.
Metomilo Rotenona
AD AC AD AC
control - - - 0
A 44,74 17,49 16,02 54,30
B 30,83 42,76 30,63 52,15
C 61,47 60,88 44,96 55,69
D 66,19 63,54 90,30 50,28
E 39,55 96,84 *41,37
AD: agua destilada y AC: Agua Cielo
®
. * No se midió este valor. A a E: Concentraciones según plaguicida empleado.
Pesticides on duckweed
105
Puede observarse que en el caso del ensayo de rotenona
AC, los valores son discordantes y no guardan relación
con el incremento de las sustancias tóxicas. Caso contrario
sucede en el ensayo de rotenona AD, donde fue posible
determinar todos los parámetros analizados.
Toxicidad aguda individual del metomilo
Al evaluar el efecto por exposición a las cinco concentraciones,
las cuales se ubicaron en un rango de 250 a 4000 mg·L
-1
del
ingrediente activo, se encontró una disminución de nuevas
frondas (NF) y el área total de las frondas (AF) a medida que
aumentó la concentración del metomilo (tabla 8).
Tabla 8. Producción de nuevas frondas y área total (mm2) en Lemna minor expuesta al metomilo
al cuarto y séptimo día de lectura.
Concentración
mg·L-1
Día 4 Día 7
Frondas Área Frondas Área
0 177 416,99 285 702,632
250 151 365,28 229 524,388
500 140 308,46 203 419,816
1000 120 206,95 149 287,251
2000 92 205,15 139 254,302
4000 71 169,73 72 162,696
Asimismo, en la segunda lectura (día 7: 168 h) se observó
una mayor toxicidad del metomilo en la concentración
más alta (g. 3), siendo mayor la necrosis respecto a las
otras concentraciones (tabla 9).
Tabla 9. Necrosis total en la fronda y el área (mm2) en Lemna minor expuesta al metomilo
al cuarto y séptimo día de lectura.
Concentración
mg·L-1
Día 4 Día 7
Frondas Área Frondas Área
0 0 0 1 1,07
250 0 0,05 5 10
500 0 0,16 1 3,08
1000 0 2,55 2 5,92
2000 3 7,72 11 27,00
4000 24 47,39 54 111,60
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106
Figura 3. Número de frondas en Lemna minor durante las dos lecturas realizadas (metomilo).
Co: Control; R1: 250 mg·L-1; R4: 2000 mg·L-1 y R5: 4000 mg·L-1. A: Lectura a las 96h;
B: Lectura a las 168h. Las imágenes no han sido capturadas a una misma distancia.
A
1 mm
1 mm
2 mm
2 mm
1 mm
1 mm
2 mm
2 mm
B
Por otro lado, la clorosis varió según el día de lectura
(tabla 10), siendo la concentración de 2000 mg·L-1 la
que obtuvo el valor más alto al termino del séptimo día.
La concentración de 4000 mg·L-1 no presentó este efecto
totóxico.
Tabla 10. Clorosis total en la fronda y el área (mm2) en Lemna minor expuesta al metomilo según el día de lectura.
Concentración
mg·L-1
Día 4 Día 7
Frondas Área Frondas Área
0 0 0 0 0
250 0 0 0 0
500 0 0 2 3,64
1000 0 0 5 3,56
2000 2 1 3 4,81
4000 0 0 1 0
Tasa de crecimiento e inhibición del crecimiento
El grupo control presentó una tasa de crecimiento (µ)
superior a las concentraciones empleadas en el presente
estudio, tanto en el parámetro NF (0,22) como en el
parámetro AF (0,24), siendo el margen de variación
entre ambos parámetros de 0,02. En la tabla 11 se
observa que hubo una reducción gradual de la tasa de
crecimiento a medida que se aumentó la concentración
del metomilo en el medio, llegando a valores cercanos
a cero para la concentración más alta. Ello se corrobora
con el cálculo de la inhibición de crecimiento (Ir), el cual
es signicativamente alto en la concentración de 4000
mg·L-1 cuando se consideran los parámetros NF y CTC,
reduciéndose levemente con los parámetros AF y PH.
Pesticides on duckweed
107
Tabla 11. Determinación de la tasa de crecimiento e Inhibición del crecimiento de los parámetros
evaluados en Lemna minor expuesta al metomilo.
C µ NF % Ir NF µ AF % Ir AF % Ir PH % Ir CTC
0 0,22 - 0,24 - - -
250 0,18 15,10 0,19 11,84 14,31 6,47
500 0,17 20,69 0,15 29,33 38,62 34,77
1000 0,14 37,19 0,15 31,37 57,12 57,77
2000 0,11 48,18 0,10 51,85 60,62 65,62
4000 0,02 90,40 0,03 86,48 80,38 98,16
C: Concentración en mg·L-1; µ: tasa de crecimiento; Ir: Inhibición de la respuesta; NF: Nuevas frondas; AF; Área
de la fronda; PH: Peso húmedo y CTC: Contenido total de clorola.
Determinación de los valores del Método Punto de
Referencia
Se utilizó el modelo dicotómico mencionado en la
metodología, considerando las concentraciones de 0, 250,
500, 1000, 2000 y 4000 mg·L-1 y la lectura a las 168 h. Al
utilizar el parámetro NF como respuesta se observó que sólo
el modelo Quantal-Linear fue adecuado para el análisis de
los datos (tabla 12), siendo los valores de BMD y de BMDL
fueron de 1255,28 mg·L-1 y 328,939 mg·L-1, respectivamente.
Tabla 12. Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (mg·L
-1
) utilizando el paráme-
tro NF (número de frondas) como respuesta para los modelos dicotómicos en Lemna minor (metomilo; lectura 168 h).
Modelo valor de p x2BMD BMDL
Gamma 0,99 0,15 1354 1186,86
Logistic 0,72 2,08 1541,92 1404,22
Log-Logistic 0,99 0,28 1382,54 1204,22
Log-Probit 0,99 0,06 1322,72 1154,57
Multistage 0,17 7,65 1193,83 1026,59
Probit 0,91 0,95 1453,24 1311,79
Weibull 0,98 0,34 1407,26 1227,85
Quantal-Linear 0 30,85 1255,28 328,939
Cuando se analizó el parámetro AF como respuesta, los
modelos Multistage, Probit, y Quantal-Linear obtuvieron los
mejores resultados para el cálculo de los valores de BMD y
BMDL (tabla 13). Al igual que en el parámetro anterior, se
tomó en cuenta aquel modelo que tuviese un valor de p lo más
cercano a cero. No obstante, dos de los modelos presentaron
dicha característica por lo que se optó por el Quantal-Linear
puesto que tuvo un valor de x2 superior al modelo Multistage.
Para el modelo elegido los valores de BMD y BMDL se
situaron en 525,91 y 431,08 en mg·L-1, respectivamente.
Tabla 13 Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (mg·L
-1
) utilizando el paráme-
tro AF (área de la fronda) como respuesta en los modelos dicotómicos en Lemna minor (metomilo; lectura 168 h).
Modelo valor de p x2BMD BMDL
Gamma 0,03 8,81 1005,61 928,35
Logistic 0,02 11,04 1038,38 977,13
Log-Logistic 0,02 9,28 1009,9 931,61
Log-Probit 0,03 8,48 1001,54 927,63
Multistage 0 43,95 730,74 681,70
Probit 0,00 17,04 939,67 883,44
Weibull 0,01 10,11 1022,93 934,96
Quantal-Linear 0 145,96 525,91 431,08
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108
En el siguiente gráco se incluye el rango de posibles valores de NOAEL con nes comparativos (g.4).
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Fraction Affected
dose
Quantal Linear Model, with BMR of 10% Extra Risk for the BMD and 0.95 Lower Confidence Limit for the BMDL
11:51 08/27 2015
BMDL BMD
Quantal Linear
BMD Lower Bound
Figura 4. Curva de dosis-respuesta del modelo continúo Quantal-Linear utilizando el parámetro AF
(área de la fronda) como valor de respuesta por efecto del metomilo para la determinación del BMD
(punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) en Lemna minor.
NOAEL
Determinación de la CE50 mediante el análisis Probit
Por otro lado, no se consideró a la clorosis como toxicidad
debido a que su presencia fue poco signicativa,
encontrándose en las concentraciones de 500 71,56 mg·L-
1, 1000 mg·L-1 y 2000 mg·L-1. La cantidad de clorosis
hallada mediante el programa ImageJ no permitió su
posterior análisis. La concentración efectiva media fue
mayor cuando se utilizó el parámetro de frondas (NF),
con 3383,54 mg·L-1 aunque no hubo una variación
signicativa con respecto a la CE50 del área (AF), el cual
fue de 3313,51 mg·L-1 (tabla 14).
Tabla 14. Concentración Efectiva Media (CE50) de dos parámetros utilizando la necrosis como respuesta
totóxica del metomilo en Lemna minor. Chi2 área: 0,17; Chi2 fronda: 0,10.
Parámetro
EC10 EC50
área fronda área fronda
Estimación mg·L-1 1992,01 2193,63 3313,51 3383,54
Inferior 95% 1457,67 1299,07 2872,47 2762,25
Superior 95% 2350,43 2697,61 4037,31 4627,03
Al comparar el valor intermedio que existe entre los lími-
tes inferior y superior de las concentraciones halladas, se
encuentra que cuando se utiliza el área se reduce la varia-
ción entre ambos límites.
Toxicidad aguda individual de la rotenona
Al evaluar el efecto por exposición a las cinco
concentraciones entre los 250 y 2000 mg·L-1 del
ingrediente activo durante el ensayo nal, se observó
una mortalidad total en las dos concentraciones más
altas (1000 mg·L-1 y 2000 mg·L-1) a partir del cuarto día
(lectura 96h), lo cual que sugiere una alta toxicidad del
plaguicida (tabla 15).
Pesticides on duckweed
109
Tabla 15. Producción de nuevas frondas y área total (mm2) en Lemna minor expuesta a la roteno-
na según el día de lectura.
Concentración
mg·L-1
día 4 día 7
frondas área frondas área
0 100 178,95 165 275,48
125 78 144,10 114 200,56
250 89 131,48 123 197,17
500 76 121,52 100 160,07
1000 59 117,47 59 117,47
2000 56 111,27 56 111,27
Por otro lado, la clorosis no guardó una relación de
dependencia con las concentraciones utilizadas. En la
siguiente tabla se muestran los resultados de la clorosis
obtenida (tabla 16).
Tabla 16. Clorosis total en la fronda y el área (mm
2
) en Lemna minor expuesta a la rotenona según el día de lectura.
Concentración día 4 día 7
frondas área frondas área
0 6 7,63 24 24,89
125 5 8,09 9 18,58
250 6 12,42 10 21,85
500 4 2,70 6 3,31
1000 4 5,07 2 2,59
2000 0 0 0 0
Caso contrario sucedió con la necrosis, cuyos valores
guardaron relación con el nivel de concentración utilizado
(tabla 17). En el caso de la concentración más alta (2000
mg·L-1), el área total corresponde a la cantidad de tejido
necrótico. En la concentración de 1000 mg·L-1 la necrosis
fue predominante aunque hubo presencia de tejido vivo.
Tabla 17. Necrosis total en la fronda y el área (mm
2
) en Lemna minor expuesta a la rotenona según el día de lectura.
Concentración día 4 día 7
frondas área frondas área
0 2 1 7 11,30
125 0 0,7 3 9,68
250 3 3,85 6 17,26
500 4 9,89 6 12,16
1000 43 73,49 43 105,73
2000 55 109,42 56 111,27
En la siguiente gura 5 se observa el comportamiento de
las colonias sometidas a las diferentes concentraciones en
dos intervalos de tiempo.
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110
Figura 5. Número de frondas en Lemna minor expuesta a la rotenona durante las dos lecturas realizadas.
Co: Control; R1: 125 mg·L-1; R4: 1000 mg·L-1 y R5: 2000 mg·L-1. A: Lectura a las 96h; B: Lectura a las
168h. Las imágenes no han sido capturadas a una misma distancia.
B
A
1 mm
1 mm
1 mm
1 mm
1 mm
2 mm
1 mm
1 mm
Además, en la gura mostrada se observa la presencia
de clorosis en el control desde la segunda lectura, lo
cual puede deberse al uso de agua destilada pura como
medio para el ensayo. Asimismo, puede observarse que
la mortalidad en la concentración de 1000 mg·L-1 fue
progresiva hasta alcanzar la necrosis total.
Tasa de crecimiento e inhibición del crecimiento
En cuanto la tasa de crecimien
to (µ) del control, se
encontraron diferencias entre el parámetro NF (0,16)
y el parámetro AF (0,12), siendo el primer parámetro
el que mostró mayor variación entre el dato control y
la concentración más alta (tabla 18). Este resultado fue
similar en la inhibición del crecimiento, donde la medición
a través de la fronda mostró mayor sensibilidad en la
concentración más alta, con un 96,74% de inhibición de
nuevas frondas frente al 84,61% de inhibición del área. El
caso del peso húmedo (PH) fue menos sensible, mostrando
un 77,53% de inhibición en la concentración más alta.
Tabla 18. Determinación de la tasa de crecimiento e Inhibición del crecimiento de los parámetros
evaluados en Lemna minor expuesta a la rotenona.
Cµ NF % Ir NF µ AF % Ir AF % Ir PH % Ir CTC
0 0,16 - 0,12 - - -
125 0,10 33,10 0,07 45,18 34,45 16,01
250 0,11 26,30 0,08 36,92 33,33 30,63
500 0,08 46,48 0,05 59,88 45,31 44,95
1000 0,01 92,07 0,01 85,89 66,29 90,30
2000 0,00 96,74 0,02 84,61 77,52 *
C: Concentración en mg·L-1; µ: tasa de crecimiento; Ir: Inhibición de la respuesta; NF: Nuevas frondas; AF; Área de la
fronda; PH: Peso húmedo y CTC: Contenido total de clorola. *No se efectuó la medición de este dato.
Determinación de los valores del Método Punto de
Referencia
Al evaluar el parámetro NF como respuesta se
encontró
que, con excepción de los modelos Log-Logistic, Log-
Probit y Weibull, todos los demás fueron favorables para el
cálculo del BMD y el BMDL con los datos utilizados (tabla
19), siendo el modelo Quantal-Linear el escogido para la
determinación de estos valores, los cuales fueron de 164,04
mg·L
-1
para BMD y 139,38 mg·L
-1
para el BMDL.
Pesticides on duckweed
111
Tabla 19. Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (mg·L
-1
) utilizando el
parámetro NF (número de frondas) como respuesta en los modelos dicotómicos (rotenona; lectura 168 h).
Modelo valor de p x2BMD BMDL
Gamma 0 83,41 164,04 139,38
Logistic 0,00 16,01 439,30 391,45
Log-Logistic 0,84 0,99 650,91 545,82
Log-Probit 0,83 0,87 614,09 534,89
Multistage 0,00 24,67 349,13 316,22
Probit 0,00 22,37 394,43 350,80
Weibull 0,84 0,81 653,39 538,06
Quantal-Linear 0 83,41 164,04 139,38
Del mismo modo, el análisis del parámetro AF mostró
valores de p adecuados en los modelos Logistic,
Multistage, Probit y Quantal-Linear (tabla 20). Debido
a que todos los modelos mencionados arrojaron valores
de p semejantes se optó por escoger el modelo Quantal-
Linear, que obtuvo el valor más alto en el x2. Los valores
obtenidos para BMD de 118,893 mg·L-1 y para BMDL
de 106,137 mg·L-1. Por otro lado, se representan los
valores de BMD y BMDL (gura 6) de manera gráca.
Se ha utilizado el modelo Quantal-Linear del parámetro
AF, incluyendo además el valor de NOAEL con nes
comparativos.
Tabla 20. Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) utilizando el paráme-
tro AF (área de la fronda) como respuesta en los modelos dicotómicos en Lemna minor (rotenona; lectura 168 h).
Modelo valor de p x2BMD BMDL
Gamma 0,34 4,47 554,76 521,80
Logistic 0 36,04 365,08 333,29
Log-Logistic 0,34 3,34 599,36 532,26
Log-Probit 0,34 3,32 580,78 527,63
Multistage 0 57,09 289,69 269,09
Probit 0 47,1 321,92 293,89
Weibull 0,35 3,28 622,91 537,34
Quantal-Linear 0 160,48 118,89 106,13
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 500 1000 1500 2000
Fraction Affected
dose
Quantal Linear Model, with BMR of 10% Extra Risk for the BMD and 0.95 Lower Confidence Limit for the BMDL
16:38 08/26 2015
BMDL BMD
Quantal Linear
BMD Lower Bound
Figura 6. Curva de dosis-respuesta del modelo continuo Log-Logistic utilizando el parámetro AF (área
de la fronda) y el área con necrosis como valores de respuesta por efecto de la rotenona para la determi-
nación del BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) en Lemna minor.
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Hidalgo-Nicho & José Iannacone
112
Determinación de la CE50 mediante el análisis Probit
Al estimar la concentración efectiva media para ambos
parámetros (tabla 21) se observa una gran diferencia
entre la EC50 del área (769,03 mg·L-1) y la fronda (858,63
mg·L-1). Ello puede deberse al valor de x2 establecido para
cada parámetro, siendo más alto en el área.
Tabla 21. Concentración Efectiva Media (EC50) de dos parámetros utilizando la necrosis como respuesta
totóxica de la rotenona en Lemna minor. Chi2 del área: 3,757; Chi2 de la fronda: 0.839.
Parámetro EC10 EC50
área fronda área fronda
Estimación mg·L-1 587,32 614,11 769,03 858,63
Inferior 95% 471,90 448,78 685,96 756,87
Superior 95% 664,00 710,38 827,78 937,07
Toxicidad binaria de la Rotenona y el Metomilo
Al evaluar los parámetros de NF y AF se encontró que
todas las concentraciones presentaron efectos similares al
término del ensayo (tabla 22), donde la concentración
más baja (B) tuvo una diferencia de 10 frondas con res-
pecto a la concentración más alta (F) en el séptimo día.
No obstante, el parámetro AF permitió observar una ma-
yor variabilidad en ambas lecturas.
Tabla 22. Producción de nuevas frondas y área total (mm2) en Lemna minor expuesta a la mezcla de metomilo y
rotenona según el día de lectura. Den.: Denominación de la concentración; Met.: metomilo; Rot.: rotenona.
Concentración en mg·L-1 día 4 día 7
Den. Met. Rot. frondas área frondas área
A 0 0 65 172,96 103 267,32
B 250 125 55 183,97 65 201,01
C 500 250 57 178,06 60 188,21
D 1000 500 54 165,50 57 179,12
E 2000 1000 55 164,65 55 164,65
F 4000 2000 55 170,87 55 170,87
La incidencia de la clorosis fue poco pronunciada y estuvo
ausente en las dos concentraciones más altas (tabla 23).
Además, se evidencia la reducción de la clorosis total en la
concentración C, lo que puede deberse a un aumento de
la necrosis en dicha concentración. La misma situación
se da con el control (gura 7).
Tabla 23. Clorosis total en la fronda y el área (mm2) en Lemna minor expuesta a la mezcla de metomilo y rotenona según
el día de lectura. Den.: Denominación de la concentración; Met.: metomilo; Rot.: rotenona.
Concentración en mg·L-1 día 4 día 7
Den. Met. Rot. frondas área frondas área
A 0 0 3 7,03 0 0
B 250 125 2 4,42 4 5,93
C 500 250 2 8,84 4 0
D 1000 500 2 2,89 0 0,34
E 2000 1000 0 0 0 0
F 4000 2000 0 0 0 0
Pesticides on duckweed
113
En este ensayo se observó que se tornaron cloróticas al
cuarto día se tornaron necróticas para el séptimo día.
A continuación se muestra el comportamiento de las
colonias de una repetición del control (g. 7).
Figura 7. Efectos totóxicos en el control en Lemna minor. Repetición n°6.
1 mm
1 mm
1 mm
Por otro lado, la necrosis tuvo un gran efecto en todas
las concentraciones empleadas, existiendo un aumento
desde el día al día 7 (segunda lectura). En la tabla 24
se muestran los valores obtenidos en cada concentración.
Tabla 24. Necrosis total en la fronda y el área total (mm2) en Lemna minor expuesta a la mezcla de metomilo y
rotenona según el día de lectura. Den.: Denominación de la concentración; Met.: metomilo; Rot.: rotenona.
Concentración en mg·L-1 día 4 día 7
Den. Met. Rot. frondas área frondas área
A 0 0 2 4,25 10 28,53
B 250 125 3 16,89 20 55,35
C 500 250 4 15,52 27 83,33
D 1000 500 19 31,74 39 126,41
E 2000 1000 36 97,78 54 164,65
F 4000 2000 41 107,35 55 170,87
En la gura 8 se observa que la concentración F tiene un
color distinto a la concentración de E a pesar de que ambos
son tejidos necróticos. Ello puede deberse a que la cantidad
de tóxico empleado podría inducir a una degeneración de
la fronda. La respuesta de la concentración más baja (B)
fue similar a la respuesta del control, el cual no presentó
efectos totóxicos pronunciados en L. minor. No obstante,
se destaca que la producción de nuevas frondas tanto para el
grupo control como para las demás concentraciones fue muy
limitada hasta el cuarto día de iniciado el ensayo.
Figura 8. Efectos totóxicos de la mezcla binaria en Lemna minor a las 96h y 168h. Co: Con-
trol; R1: B mg·L-1; R4: E mg·L-1 y R5: F mg·L-1. A: Lectura a las 96h; B: Lectura a las 168h. Las
imágenes no han sido capturadas a una misma distancia.
1 mm 1 mm 1 mm 1 mm
1 mm
1 mm1 mm
1 mm
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114
Tasa de crecimiento e inhibición del crecimiento
La tasa de crecimiento se redujo drásticamente en todas las
concentraciones y los dos parámetros evaluados (tabla 25),
existiendo una diferencia de 0,08 puntos entre el control
y la menor concentración utilizada (B) para el parámetro
NF y 0,07 puntos para el parámetro AF. Respecto a la
inhibición del crecimiento, los valores son similares en
el parámetro NF y AF, superando el 90% en ambos a
partir de la concentración D para el primer parámetro y
desde la concentración C para el segundo. No obstante,
el parámetro CTC reeja una mayor correlación con la
concentración utilizada, existiendo una inhibición del
39,69% en la menor concentración (B) y una inhibición
del 93,71% en la concentración más alta (F). Por otro
lado, el parámetro PH muestra una inhibición similar en
todas las concentraciones.
Tabla 25. Determinación de la tasa de crecimiento e Inhibición del crecimiento de los parámetros evaluados en Lemna
minor expuesta a la mezcla de metomilo y rotenona.
Concentración en mg·L-1
µ NF % Ir NF µ AF % Ir AF % Ir PH % Ir
CTC
Den. met. rot.
A 0 0 0,09 - 0,08 - - -
B 250 125 0,02 71,28 0,01 83,66 59,55 39,69
C 500 250 0,01 83,68 0,006 93,00 70,74 56,83
D 1000 500 0,008 91,62 0,007 91,72 61,44 61,33
E 2000 1000 0,003 97,15 0,002 97,72 69,79 90,07
F 4000 2000 0,003 97,15 0,002 97,89 75,21 93,71
Den.: Denominación de la concentración; met.: metomilo; rot.: rotenona; C: Concentración en mg·L-1; µ: tasa de crecimiento; Ir:
Inhibición de la respuesta; NF: Nuevas frondas; AF; Área de la fronda; PH: Peso húmedo y CTC: Contenido total de clorola.
Determinación de los valores del Método Punto de Re-
ferencia
Al evaluar el parámetro NF se encontró que el modelo
Log-Logistic fue el que mejor respondió a los datos
analizados (Tabla 26). En el caso del metomilo, el valor
de BMD calculado fue de 210,05 mg·L-1, mientras que
el BMDL fue de 139,12 mg·L-1. En contraste con este
plaguicida, la rotenona presentó un nivel de BMD y
BMDL inferior, situándose en 105,01 mg·L-1 y 69,56
mg·L-1, respectivamente.
Tabla 26. Valores de BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (en
mg·L-1) utilizando el parámetro NF (número de frondas) y las frondas necróticas como respuesta en los
modelos dicotómicos en Lemna minor (Mezcla binaria; lectura 168 h).
Modelo valor de p X2Metomilo Rotenona
BMD BMDL BMD BMDL
Gamma 0,01 10,67 159,75 87,30 79,87 43,65
Logistic 0,06 8,81 207,20 177,91 103,60 88,95
Log-Logistic 0 23,64 210,05 139,12 105,01 69,56
Log-Probit 0,00 20,17 206,87 141,72 103,43 70,86
Multistage 0,14 5,36 131,96 88,98 65,98 44,49
Probit 0,21 5,83 200,07 173,87 100,03 86,93
Weibull 0,04 8,14 156,42 92,81 78,21 46,40
Quantal-Linear 0,00 23,34 85,25 72,04 42,62 36,02
Asimismo, en el parámetro AF se evidenció una res-
puesta favorable en tres modelos, destacando el modelo
de Log-Logistic para el cálculo de los valores de BMD
y BMDL (Tabla 27). En el metomilo dichos valores se
Pesticides on duckweed
115
situaron en 258,47 mg·L-1 y 205,65 mg·L-1 respectiva-
mente; en el caso del plaguicida rotenona estos valores
fueron de 129,23 mg·L-1 y 102,82 mg·L-1, respectiva-
mente.
Tabla 27. Valores de BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (en
mg·L-1) utilizando el parámetro AF (área de la fronda) como respuesta en los modelos dicotómicos en
Lemna minor (Mezcla binaria; lectura 168 h).
Modelo valor de
pX2Metomilo Rotenona
BMD BMDL BMD BMDL
Gamma 0,01 10,67 206,68 156,09 103,34 78,04
Logistic 0,06 8,81 202,55 185,44 101,27 92,72
Log-Logistic 0 23,64 258,47 205,65 129,23 102,82
Log-Probit 0,00 20,17 250,08 202,61 125,04 101,30
Multistage 0,14 5,36 168,51 126,71 84,25 63,35
Probit 0,21 5,83 192,29 177,16 96,14 88,57
Weibull 0,04 8,14 202,74 155,00 101,37 77,50
Quantal-Linear 0,00 23,34 83,79 76,02 41,89 38,01
En la gura 9 se realiza una comparación del NOAEL ver-
sus el valor de BMDL. Se ha utilizado el modelo continuo Log-Logistic del parámetro AF con las concentraciones em-
pleadas del plaguicida metomilo durante la mezcla binaria.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Fraction Affected
dose
Log-Logistic Model, with BMR of 10% Extra Risk for the BMD and 0.95 Lower Confidence Limit for the BMDL
23:09 08/26 2015
BMDL BMD
Log-Logistic
BMD Lower Bound
Figura 9. Curva dosis-respuesta del modelo continuo Multistage utilizando el parámetro AF (área
de la fronda) como valor de respuesta a la mezcla de metomilo y rotenona para la determinación
del BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) en Lemna minor.
Determinación de la CE50 mediante el análisis Probit
Con respecto a la concentración efectiva media, el
parámetro NF presentó una menor variación entre el
límite inferior y superior frente al parámetro AF (Tabla
28). Para el caso del primer parámetro, se estimó una CE50
de 587,72 mg·L-1 (metomilo) y 293,86 mg·L-1 (rotenona)
la cual fue ligeramente menor que la CE50 estimada para
el parámetro AF: 616,02 mg·L-1 (metomilo) y 308,00
mg·L-1 (rotenona).
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116
Tabla 28. Concentración Efectiva Media (EC50) de dos parámetros utilizando la necrosis como
respuesta totóxica de la mezcla de metomilo y rotenona en Lemna minor.
Parámetro EC50 met EC50 rot
área fronda área fronda
Estimación mg·L-1 616,02 587,72 308,00 293,86
Inferior 95% 279,82 467,67 139,92 233,84
Superior 95% 942,61 710,27 471,30 355,13
met.: metomilo; rot.: rotenona. Chi2 del área met: 19,281; Chi2 de la fronda met: 6,477; Chi2 de la fronda
rot: 6,477, Chi2 del área rot: 19,283.
Determinación del efecto sinérgico
S
e utilizó el modelo de Concentración – Adición para
determinar el efecto causado por la mezcla de ambos
plaguicidas. Para ello, la CE50 estimada se obtuvo de la
suma de las concentraciones efectivas medias halladas en
los ensayos de toxicidad individual. Para el parámetro NF
ambos plaguicidas mostraron valores de CA mayores a 1,
lo cual indica un efecto sinér
gico (tabla 29). Dicho efecto,
es mayor en la rotenona que en el metomilo puesto que
en el primer plaguicida se registran valores más elevados
de CA.
Tabla 29. Concentración Efectiva Media (EC
50
) estimada y experimental del parámetro NF (número de fron-
das) para el cálculo del valor concentración-adición de la mezcla de metomilo y rotenona en Lemna minor.
Parámetro CE50 estimada CE50 experimental CA
met. rot. met. rot.
Estimación mg·L-1 4242,17 587,72 293,86 7,22 14,44
Inferior 95% 3519,13 467,68 233,84 7,52 15,05
Superior 95% 5564,10 710,27 355,14 7,83 15,67
met.: metomilo; rot.: rotenona; CA: Concentración-adición.
Lo mismo sucede al analizar el parámetro AF para deter-
minar el valor de CA (Tabla 30), donde se destaca la alta
variación de dicho valor para el plaguicida rotenona.
Tabla 30. Concentración Efectiva Media (EC
50
) estimada y experimental del parámetro AF (área de la fronda)
para el cálculo del valor concentración-adición de la mezcla de metomilo y rotenona en Lemna minor.
Parámetro CE50 estimada CE50 experimental CA
met. rot. met. rot.
Estimación mg·L-1 4082,54 616,02 308,00 6,63 13,25
Inferior 95% 3558,44 279,82 139,92 12,72 25,43
Superior 95% 4865,09 942,62 471,31 5,16 10,32
met.: metomilo; rot.: rotenona; CA: Concentración-adición.
Empleo de los valores del Método Punto de Referencia
para la determinación de la concentración efectiva
Debido a que el cálculo de los valores de BMD y BMDL
son novedosos en su aplicación para estudios con L.
minor, se utilizaron dos métodos para el análisis de los
parámetros NF y AF. En el primer método, aplicado en el
presente estudio, se consideró como dato la suma de todos
los resultados obtenidos en una misma concentración para
calcular los valores de BMD y BMDL (método A). Por
otro lado, en el método B se consideró cada dato como
el promedio de las respuestas de cada concentración. La
diferencia entre ambos métodos fue notoria en todos los
ensayos analizados puesto que en el método B muchos de
Pesticides on duckweed
117
los valores de p fueron superiores a 0,005. Por ejemplo,
en el parámetro AF del ensayo de toxicidad binaria, se
encontró que ningún modelo fue adecuado cuando se
empleó el método B (tabla 31).
Tabla 31. Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (mg·L-1)
utilizando como dato al promedio de las respuestas por cada concentración en el parámetro AF (área de
la fronda) en Lemna minor (mezcla binaria; lectura 168 h).
Modelo valor de p X2BMD BMDL
Gamma 0,67 1,52 155,01 65,59
Logistic 0,86 1,26 151,91 120,31
Log-Logistic 0,33 3,38 193,85 104,28
Log-Probit 0,41 2,88 187,56 105,84
Multistage 0,85 0,77 126,38 64,67
Probit 0,93 0,83 144,21 116,26
Weibull 0,76 1,16 152,06 70,34
Quantal-Linear 0,50 3,33 62,84 48,84
En todos los ensayos analizados ambos métodos arrojaron
el mismo modelo de regresión (tabla 32), destacando el
hecho de que en el método B los valores de x2 fueron
inferiores que en el método A.
Tabla 32. Valores BMD (punto de referencia) y BMDL (nivel inferior al punto de referencia) (m·L-1) en
el parámetro AF (área de la fronda) en Lemna minor según el método empleado (mezcla binaria).
Ensayo Modelo Método Valor de p X2BMD BMDL
Rot Quantal-Linear A0 160,48 118,89 106,13
B0,004 15,01 87,04 62,72
Met Quantal-Linear A0 145,96 525,91 431,08
B0 30,63 1323,99 899,33
Mezcla
Met Log-Logistic A0 23,64 629,51 564,82
B0,33 3,38 629,50 475,73
Mezcla
Rot Log-Logistic A0 23,64 314,75 282,41
B0,33 3,38 314,75 237,86
rot: rotenona; met: metomilo: Mezcla: toxicidad binaria de ambos plaguicidas. A: promedio de las respuestas
obtenidas en cada concentración; B: suma de las respuestas obtenidas en cada concentración.
Asimismo, los valores de BMDL tienen una gran variación
en los ensayos de toxicidad individual. Caso contrario
sucede en el ensayo de toxicidad binaria, donde los valores
obtenidos para BMD son similares en ambos métodos.
Por otro lado, el valor de BMD utilizado en el presente
estudio se calculó con un 10% de respuesta del efecto
observado (necrosis), por lo que puede compararse con la
concentración efectiva al 10% - EC10 obtenido del análisis
Probit durante el cálculo de la concentración efectiva
media. Al realizar esta comparación en el parámetro
AF, se observa que el valor de BMD se encuentra entre
los límites superior e inferior en el ensayo de toxicidad
binaria (tabla 33).
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118
Tabla 33. Valores de la EC10 y del BMD (punto de referencia) (mg·L-1) en el parámetro AF (área
de la fronda) en Lemna minor.
met rot Mezcla met Mezcla rot
EC10 1992,01 587,32 249,93 124,20
EC10 lim. inf. 1457,67 471,90 33,08 23,41
EC10 lim. sup. 2350,43 664,00 442,25 211,50
BMD 525,91 118,89 258,47 129,23
EC10: Concentración efectiva al 10%; lim. sup.: límite superior; lim. inf.: límite inferior; met: metomilo;
rot: rotenona.
El valor de BMD también puede ser utilizado para
el cálculo de la CE50 si es que se modica el valor de
respuesta al 50%. Por ello, se utilizó el modelo dicotómico
del programa estadístico BMDS® (tabla 34). Al comparar
los valores de BMD50 con los valores de CE50 obtenidos
mediante el análisis Probit se observa una variación
signicativa en el ensayo de toxicidad individual con el
plaguicida metomilo.
Tabla 34. Estimación de la CE50 (concentración efectiva media) (mg·L-1) en Lemna minor utili-
zando el paquete estadístico BMDS®.
Ensayo Modelo Parámetro valor de p X2CE50
rot Quantal-Linear NF 0 83,41 1079,22
AF 0 160,48 782,17
met Quantal-Linear NF 0 89,92 7147,42
AF 0 145,96 6919,79
Mezcla met. Log-Logistic NF 0,048 7,88 597,90
AF 0 23,64 629,51
Mezcla rot. Log-Logistic NF 0,048 7,88 298,93
AF 0 23,64 314,75
rot: rotenona; met: metomilo: Mezcla: toxicidad binaria de ambos plaguicidas. NF: número de frondas;
AF: Área de frondas.
Por ejemplo, los valores de CE50 calculados mediante
el análisis Probit para los parámetros AF y NF en el
plaguicida metomilo fueron de 3313,51 mg·L-1 y 3383,54
mg·L-1, respectivamente (tabla 14). Mientras que los
valores de CE50 para el mismo plaguicida y calculados
mediante el análisis del paquete estadístico BMDS® se
ubican por encima del límite superior (tabla 35).
Tabla 35. Valores comparados de la EC50 (concentración efectiva media) (mg·L-1) en Lemna minor con
los programas estadísticos Probit y BMDS® utilizando el parámetro AF.
Valores met. rot. Mezcla met. Mezcla rot.
EC50 3313,51 769,03 615,84 301,16
EC50 lim. inf. 2872,47 685,96 279,79 154,12
EC50 lim. sup. 4037,31 827,78 942,34 444,31
EC50 (BMD) 6919,79 782,17 629,51 314,75
EC50: Concentración efectiva al 50%; lim. sup.: límite superior; lim. inf.: límite inferior; met: metomilo;
rot.: rotenona.
Pesticides on duckweed
119
Con respecto al efecto sinérgico, pudo comprobarse el
resultado obtenido en el modelo de Concentración-
Adición al reemplazar los valores por la EC50 por los
valores de BMD50 del programa BMDS®, no encontrando
diferencias signicativas para el resultado de la CA en el
parámetro AF (tabla 36).
Tabla 36. Comparación de los valores de la Concentración Adición (CA) entre la EC50 (concentración
efectiva media) (mg·L-1) en Lemna minor con los programas estadísticos Probit y BMDS®. Parámetro AF
(área de la fronda).
Parámetro CE50 estimada CE50 experimental CA
met. rot. met. rot.
EC50 (BMD) 7701,96 629,51 314,75 12,23 24,46
EC50 (Probit) 4082,54 616,02 308,00 6,63 13,25
met.: metomilo; rot.: rotenona; CA: Concentración-adición.
Una situación similar sucedió con el parámetro NF (tabla
37). En ambos parámetros se observa que el valor de CA
es mayor cuando se utiliza el valor de BMD como cálculo
para la EC50.
Tabla 37. Comparación de los valores de la Concentración Adición (CA) entre la EC
50
(concentración efectiva me-
dia) (mg·L
-1
) en Lemna minor con los programas estadísticos Probit y BMDS
®
. Parámetro NF (número de frondas).
Parámetro CE50 estimada CE50 experimental CA
met. rot. met. rot.
EC50 (BMD) 8226,64 597,90 298,93 13,76 27,52
EC50 (Probit) 4242,17 587,72 293,86 7,22 14,44
met.: metomilo; rot.: rotenona; CA: Concentración-adición.
De este modo, pudo comprobarse el efecto sinérgico
causado por la interacción de los plaguicidas metomilo y rotenona.
DISCUSIÓN
Condiciones del ensayo
El análisis de los resultados debe abordarse considerando
las diversas variables que conuyen en la realización de
un ensayo. En este caso, el primer parámetro a tomar
en cuenta es la clase de agua utilizada en los ensayos de
toxicidad individual. En el presente estudio se realizaron
dos ensayos de toxicidad individual por cada plaguicida;
tanto para el caso del metomilo y la rotenona. En el
primer ensayo se consideró el empleo de agua destilada
(AD) como medio, mientras que en el segundo ensayo
se utilizó agua embotella Cielo® (AC). De este modo, los
resultados serían discriminados y analizados por grupos
(AD versus AC). No obstante, una indagación previa de
las respuestas obtenidas reveló que solo un ensayo por
cada plaguicida presentó una consistencia adecuada para
su análisis.
En el caso del metomilo fue el ensayo en donde se utilizó
agua Cielo® y, en el caso de la rotenona, el ensayo donde
se utilizó agua destilada como medio. Por ello, una de
las características más notorias en los resultados fue la
cantidad de frondas producidas en el ensayo donde se
empleó agua Cielo® (metomilo), la cual fue mayor al
ensayo donde se empleó agua destilada (rotenona).
La diferencia radica en el tipo y calidad de agua empleada.
Por ejemplo se sabe que una concentración adecuada de
calcio y magnesio en el medio promueve una óptima
absorción de sales, traduciéndose en el crecimiento de la
planta (Stiles & Jörgensen, 1914). Considerando que el
agua destilada carece de cualquier tipo de minerales, era
esperable que los parámetros de NF y AF presentaran un
mayor aumento en aquellos ensayos donde se empleó agua
Cielo como medio®, deduciendo que el agua empleada
fue un factor determinante en la cantidad obtenida en
ambos parámetros.
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120
Por otro lado, una de las ventajas de utilizar a la macrota
Lemna como un organismo bioindicador, es la presencia
de signos de toxicidad (necrosis y clorosis), los cuales son
visibles y fáciles de registrar. Se destaca que en el ensayo
donde se utilizó agua destilada como medio (rotenona),
se acentuaron dichos signos de toxicidad en el grupo
control (necrosis: 11,30 mm2; clorosis: 24,89 mm2).
Merrill (1915) ya discutía sobre los efectos de utilizar agua
destilada en organismos acuáticos, los cuales simulaban a
la toxicidad. Entre los factores que menciona el autor, se
encuentra la ausencia de calcio como un rol fundamental
para el correcto metabolismo de la planta. Asimismo, la
falta de nutrientes esenciales conduce al deterioro de la
planta, tal como se evidencia en los resultados. Otro de
los efectos registrados por el uso de agua destilada fue
identicado por Halaban & Hillman (1970), quienes
reportan la inhibición de la oración en la macrota
Lemna perpusilla (Torrey, 1843).
El efecto causado por el uso de agua destilada y agua
Cielo® no parece estar relacionado con la cantidad
utilizada por cada unidad de ensayo (50 mL), aun cuando
la OECD (2006) recomienda un mínimo de 100 mL
para dichas unidades. No obstante, debe considerarse
este factor para futuras pruebas. Otra variable que inuye
en el crecimiento de Lemna es la intensidad de luz
utilizada para los ensayos. Aun cuando la OECD (2006)
estableció un rango que oscila entre los 6500 a 10000 lux
para asegurar una máxima producción de frondas. En el
presente estudió la intensidad de luz fue de 3556,5 lux
(equivalente a 48,013 µm m2S-1). Como ello afectaría
al crecimiento teórico esperado, se optó por someter
el cultivo y los ensayos a un fotoperiodo de 24:0 horas
luz:oscuridad.
Yin et al. (2015) reportan un aumento de la densidad
poblacional en la macrota Lemna aequinoctialis
(Welwitsch, 1860) cuando fue sometida a un fotoperiodo
de 24:0 h luz:oscuridad y a intensidades de luz de 20,
50, 80 y 110 µm m2S-1, siendo la última la que produjo
mejores resultados. Debido a que la intensidad utilizada
se encuentra dentro del rango que promueve un óptimo
desarrollo de nuevas frondas en Lemna, se asume que esta
variable no causa un efecto adverso en el crecimiento de
las frondas. No obstante, se observó que en el ensayo de
toxicidad binaria la producción de nuevas frondas fue
escasa en el grupo control, aun cuando se empleó agua
Cielo® por lo que deben considerarse otros factores que
inuyeron en dicho resultado.
Si bien se utilizó una cámara de cultivo en todos los
ensayos, esta no provee el aislamiento necesario, quedando
sometida a factores ambientales (luz, temperatura y
humedad). Por ello, el ambiente donde se encontraba
fue fundamental para controlar estos parámetros. No
obstante, el ensayo de toxicidad binaria se realizó en un
ambiente distinto a las pruebas de toxicidad individual,
por lo que puede haberse producido un efecto negativo
en el cultivo madre y sus colonias al no haber considerado
un tiempo de adaptación para el nuevo ambiente.
Inhibición del crecimiento
Durante el análisis se descartó el uso de agua destilada
como un efecto causal de la sensibilidad de los parámetros
utilizados para medir la inhibición del crecimiento; ello se
estableció al comparar los parámetros de inhibición en los
cuatro ensayos de toxicidad individual realizados. Tal es el
caso del CTC, donde se muestra que los ensayos escogidos
para el análisis presentaron una mayor inhibición cuando
se sometieron a concentraciones más elevadas del tóxico.
Se observa que los valores obtenidos en los ensayos
descartados (metomilo AD y rotenona AC) no
necesariamente responden a la concentración empleada.
Por ejemplo, los resultados de la inhibición de clorola
en el ensayo de rotenona con agua Cielo® mostraron
poca variación en todas las concentraciones empleadas,
impidiendo su utilización para establecer el valor de la
concentración efectiva media.
Los demás parámetros utilizados para medir la inhibición
del crecimiento varían en cuanto a sensibilidad, siendo el
menos especíco el peso húmedo (PH) y el más especíco
el CTC para todos los ensayos. Asimismo, la producción
de nuevas frondas (NF) mostró gran sensibilidad para
los ensayos de toxicidad individual; aunque Valenzuela
(2013), en un estudio realizado en Lemna valdiviana
(Philippi, 1864), ubica a los parámetros NF y PH como
los menos sensibles para determinar la inhibición del
crecimiento.
Se concuerda con Valenzuela (2013) en cuanto al
parámetro PH, el cual tiene una gran variación según el
protocolo que se emplee para el pesado. En este estudio,
no se estableció un protocolo para efectuar dichos
cálculos, siendo necesaria una estandarización del proceso
para futuros ensayos.
Por otro lado, el parámetro del área de la fronda
(AF) mostró mayor sensibilidad en el estudio de la
mezcla binaria, seguido por el parámetro NF y CTC
respectivamente. Este resultado se debe a una mejor
interacción del autor con la interfaz del programa Image
J®, el cual amplía las posibilidades en el estudio de las
Pesticides on duckweed
121
imágenes digitales. Abràmo et al. (2014) mencionan
que este software (de código abierto) es utilizado para el
análisis de imágenes biomédicas, aunque recientemente se
han incorporado investigaciones con la macrota Lemna
sp. (Hrušková, 2012; Valenzuela, 2013; Van Hoeck et al.,
2015, entre otros).
Debido a que las investigaciones con este programa son
escasas en el área de toxicología utilizando la macrota
Lemna, aún no se han establecido parámetros de medición
especícos para detectar el área necrótica y clorótica,
quedando a la libre interpretación del investigador (Zhou
et al., 2020).
Tangou et al. (2013) utilizaron el software Image Pro-
Plus® para el análisis fotográco de L. minor. En este
estudio, establecen ciertas pautas para optimizar el
análisis de las fotografías, donde se destaca el hecho
de mantener una misma distancia entre la cámara y
las lentejitas de agua para la toma de fotografías, pauta
que no fue considerada en este estudio. De este modo,
estandarizaron el reconocimiento del color a diferentes
intensidades de RGB (Red-Green-Blue) y clasicaron al
tejido vivo y necrótico entre rangos de 100 a 255 y de 200
a 255, respectivamente. No obstante, el reconocimiento
de la intensidad de color dependió de los investigadores.
Aunque existen programas especializados para la
determinación del área y del porcentaje de clorosis y
necrosis (Eberius, 2001), el uso de programas gratuitos
para el análisis de imágenes otorga a cualquier investigador
la posibilidad de incrementar la especicidad de sus
datos, por lo que una estandarización en la metodología
se vuelve imprescindible.
Empleo de los valores del Método Punto de Referencia
Tradicionalmente se han utilizado los valores del nivel
de efecto no observable (NOAEL) y bajo nivel de
efecto observable (LOAEL) para determinar el riesgo
de la sustancia estudiada y su efecto crítico (Barlow et
al., 2009). Sin embargo, el uso del punto de referencia
(BMD) y el nivel por debajo del punto de referencia
(BMDL) son cientícamente más avanzados que el
método de NOAEL, el cual sólo deriva de los datos
obtenidos y no considera la relación existente en la curva
de la dosis y la respuesta.
El paquete estadístico utilizado para el cálculo de estos
valores cuenta con varios modelos y su utilización varía
según la especie y el tipo de estudio realizado. Asimismo,
el punto de referencia se ha utilizado en diferentes áreas
de la toxicología, la medicina y farmacología por lo que su
aplicación está ampliamente difundida en otras áreas. No
obstante, la aplicación del modelo en Lemna sp. aún es
novedosa y carece de un protocolo estandarizado (Zhou
et al., 2019).
La decisión de utilizar el modelo dicotómico responde a
la factibilidad de relacionar dos variables respuesta (tejido
vivo versus tejido muerto) y a la fácil interpretación de los
resultados a través del valor de p y el x
2
. Aunque existen otros
modelos como el de tóxico-difusión, donde se comparan
las respuestas obtenidas de un mismo organismo en varios
intervalos de tiempo a una concentración determinada.
No se consideró este modelo debido que posee una gran
complejidad a nivel estadístico. Sin embargo, no debe
descartarse la posibilidad de su aplicabilidad para futuros
estudios con L. minor.
Del mismo modo, al ser un modelo novedoso para ensayos
con L. minor, aún deben considerarse investigaciones
adicionales que permitan establecer un protocolo
adecuado para trabajar con la data obtenida (Zhou et
al., 2020). Cabe señalar que observaciones posteriores
permitieron establecer que el manejo de los datos puede
ser un factor importante al momento de determinar los
valores de BMD y BMDL.
En el presente estudio y en ambos parámetros (NF y AF)
se consideró como dato la suma de todos los resultados
obtenidos en una misma concentración para calcular los
valores de BMD y BMDL (método A). No obstante,
cuando el dato analizado fue el promedio de las respuestas
de cada concentración (método B), los resultados variaron
en ambos valores y en todos los ensayos.
El empleo del método A para hallar los valores de BMD
y BMDL ha mostrado tener una mayor certeza que la
utilización del método B. Además, aunque los modelos
de regresión con mejores resultados son los mismos en
ambos métodos, debe recalcarse la diferencia existente en
los valores de BMD y BMDL. Ello puede interpretarse
como un ajuste para reejar mayor exactitud de los
resultados en el método A.
Por otro lado, el empleo del valor de BMD como
equivalente de la EC10 arrojó valores por debajo del límite
inferior de la EC10. Lo mismo sucedió al calcular el
valor de BMD con una respuesta del 50% para realizar
un análisis comparativo entre las EC50 obtenidas en los
ensayos. Ello puede sugerir una mayor especicidad
puesto que el método del punto de referencia (BMD) nos
permite trabajar con varios modelos para encontrar el que
mejor se adapte a los datos obtenidos.
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Hidalgo-Nicho & José Iannacone
122
No obstante, debido a que los valores de BMD y BMDL
son novedosos para trabajos toxicológicos con Lemna,
es necesario realizar más estudios que permitan una
estandarización del protocolo (Zhou et al., 2019).
Efecto sinérgico
Como se mencionó anteriormente, el metomilo es
un carbamato que inhibe la acetilcolinesterasa, una
enzima encargada de hidrolizar la acetilcolina, el
cual es un neurotransmisor de la sinapsis presente en
animales e insectos (Lin et al., 2020). No obstante,
Wessler et al. (2001) han reportado la presencia de este
neurotransmisor en un amplio rango de organismos
tales como bacterias, algas, protozoos y plantas. En este
último grupo, Odjakova & Hadjiivanova (1997) reeren
que la acetilcolina puede estar involucrada en una serie
de procesos de regulación siológica, tales como la
germinación, oración, morfogenésis, la fotosíntesis y la
elongación de la planta.
Diversas investigaciones en células animales han
permitido establecer el ciclo de la acetilcolina. Cuando
esta es producida para encontrarse con sus receptores,
la acetilcolinesterasa la degrada inmediatamente en dos
productos inactivos: el acetato y la colina, siendo la
colina el que completa el ciclo de vida de la acetilcolina
(Rosenjack & Rosenthal, 2015). Aunque existen estudios
que han establecido la biosíntesis de la colina en las plantas
a través de la vía etanolamina (Subbarao et al., 2001),
también se ha demostrado la presencia de acetilcolina
en el tejido de las plantas, además de la existencia de las
enzimas involucradas en su síntesis. Bajo esta vía, la colina
es transformada por dos transferasas en fosfatidilcolina, el
cual es uno de los mayores fosfolípidos en las membranas
biológicas (Tretyn, 1991).
Ello guarda relación con los resultados obtenidos por
Kandeler et al. (1974), quienes estudiaron la respuesta
de la acetilcolina en Lemna gibba (Linnaeus, 1753). Sus
resultados mostraron que la acetilcolina parece alterar
la permeabilidad de la membrana cuando el medio está
acidicado, alterando su metabolismo y produciendo un
intercambio de iones de hidrógeno por iones de potasio.
Debido a que la colinesterasa presente en las plantas
es sensible a los derivados del ácido carbámico y los
compuestos organofosforados (Roshchina, 2004), la
exposición al plaguicida metomilo puede producir un
desequilibrio en el intercambio de iones Ca – K de la
membrana y por ende, la ruptura y muerte celular.
Moussa et al. (1989) mencionan que este plaguicida causa
un incremento en la permeabilidad de la membrana, lo
que corroboraría su acción al inhibir la colinesterasa (Lin
et al., 2020).
El hecho de que los resultados del presente estudio
mostraran una baja sensibilidad de L. minor frente al
metomilo, puede sugerir que existe una mayor síntesis
de la colina por medio de la vía etanolamina, lo que
reduciría el efecto totóxico. Otra posibilidad nos lleva
a mencionar la capacidad de respuesta del organismo
frente al agente xenobiótico, la cual sería efectiva con
concentraciones inferiores a 1637,31 mg·L-1 (BMD:
parámetro AF). Ello hace necesario contar con estudios
especícos que evalúen la respuesta de la membrana
celular en L. minor cuando es sometida a concentraciones
de metomilo.
Por otro lado, la alta toxicidad de L. minor al ser
sometida a la rotenona, responde al hecho de que este
plaguicida causa daños directos en la mitocondria,
especícamente en la cadena respiratoria a través del
complejo I y despolimerizando los microtúbulos de esta
organela. Cabe señalar que en la mitocondria se producen
las especies reactivas al oxígeno (ROS por sus siglas en
inglés) o moléculas derivadas de la utilización del oxígeno
en la célula. Las ROS como el superóxido, es detoxicado
y transformado a peróxido de hidrógeno por medio de
otras moléculas, el cual es un importante regulador de
la actividad celular (Bolisetty & Jaimes, 2013; Wu et al.,
2020).
Este proceso es realizado, en su mayoría, en los complejos I
y II de la cadena respiratoria (Wu et al., 2020). Asimismo,
otro aspecto importante a mencionar, es la relación
que tiene la mitocondria con el proceso apoptótico
de la célula (Li, 2003). Los cambios que producen la
presencia de moléculas de rotenona en el complejo I,
alteran el equilibrio de la producción de las moléculas
ROS, ocasionando la estimulación de la mitocondria
a respuestas pro-apoptóticas y un cambio letal en la
permeabilización de la membrana mitocondrial con una
subsecuente ruptura de la membrana externa y muerte
celular (Le Bras et al., 2005; Wu et al., 2020).
Debido a que la rotenona causa daños signicativos en
la célula (Wu et al., 2020), se asume que la macrota
L. minor es incapaz de reducir el efecto causado por el
segundo plaguicida (metomilo), lo que se traduce en un
aumento del efecto totóxico y una mayor sensibilidad a
la acción combinada de ambos plaguicidas.
Lemna minor es un sistema ideal para el estudio combinado
de la totoxicidad que podría ser usado como monitoreo
de rutina para la salud ambiental de los ecosistemas
Pesticides on duckweed
123
acuáticos (Tagun & Boxall, 2018; Kostopoulou et al.,
2020).
Se concluye que la sensibilidad de la macrota L. minor
varió en los ensayos de toxicidad individual, siento menor
cuando se utilizó el plaguicida metomilo (EC50; Parámetro
AF: 6919,79 mg·L-1 y parámetro NF: 7147,42 mg·L-1)
en comparación con la rotenona (EC50; Parámetro AF:
782,17 mg·L-1 y parámetro NF: 1079,22 mg·L-1). La
evaluación del parámetro área total (AF) mostró mayor
sensibilidad frente al parámetro nuevas frondas (NF)
al momento de determinar la concentración efectiva al
10% y 50% (EC10 y EC50, respectivamente) en todos los
ensayos. El modelo de Concentración-Adición mostró un
efecto sinérgico en los parámetros evaluados (AF y NF)
puesto que los valores obtenidos fueron mayores a uno.
Dicho efecto sinérgico fue mayor en el parámetro NF
(27,52 rotenona y 13,76 metomilo) que en el parámetro
AF (24,46 rotenona y 12,23 metomilo). El parámetro de
CTC fue el más sensible al momento de determinar el
porcentaje de inhibición de crecimiento en los ensayos
de toxicidad individual (65,62% en 2000 mg·L-1 de
metomilo y 90,30% en 2000 mg·L-1 de rotenona). En
el caso del ensayo de toxicidad binaria, el parámetro AF
presentó mayor sensibilidad (la combinación 2000 mg·L-
1 de rotenona y 4000 mg·L-1 de metomilo causan una
inhibición del 97,89%). Asimismo, el parámetro de peso
húmedo (PH) fue el menos sensible en todos los ensayos.
El modelo Punto de Referencia (BMD – Benchmark
dose) utilizado a través del programa estadístico BMDS®,
resultó tener una mayor especicidad para el cálculo de
la concentración efectiva media – EC50 que el programa
computarizado Probit, con el cual se obtuvieron valores
de EC50 con grandes márgenes de variación.
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