259
ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2020, 17(2), jul-dic.: 259-267.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
COAGULANT AND PHOSPHOLIPASE A2 ACTIVITY OF THE SEA
ANEMONE PHYMANTHEA PLUVIA (DRAYTON, 1846) AND THE
TARANTULA GRAMMOSTOLA ROSEA (WALCKENAER, 1837) VENOMS
ACTIVIDAD COAGULANTE Y DE FOSFOLIPASA A2 DE LOS VENENOS DE
LA ANÉMONA DE MAR PHYMANTHEA PLUVIA (DRAYTON, 1846) Y DE LA
TARÁNTULA GRAMMOSTOLA ROSEA (WALCKENAER, 1837)
Nathalie Mariel Yafac-Piedra1 & Fred Garcia-Alayo1,*
1 Laboratorio de Química. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma. Lima, Perú.
E-mail: nathalie.yafac@urp.edu.pe / fgarciaa@urp.edu.pe
* Corresponding author: fgarciaa@urp.edu.pe
ABSTRACT
e coagulant and phospholipase A2 activity of the sea anemone Phymanthea pluvia (Drayton, 1846) and tarantula
Grammostola rosea (Walckenaer, 1837) venoms from San Bartolo and Matucana, Lima, Peru, respectively, have been
studied. e sea anemone venom was obtained by hypotonic shock, while the tarantula venom was extracted from the
chelicerae and was "diluted" in saline solution. Electrophoretic analysis of the soluble venom showed the presence of
protein bands. e coagulant and phospholipase activities of both venoms were measured. Phospholipase activity was
found showing a di usion halo of 2.76 cm for P. pluvia and 3.35 cm for G. rosea. e coagulant activity, tested on
human citrated plasma, gave a positive result for P. pluvia, coagulating the plasma in 10 min and 16 min for G. rosea. It
is concluded that both the soluble venoms of P. pluvia and G. rosea have phospholipase and coagulant activity.
Keywords: coagulant – phospholipase – sea anemone – tarantula – venom
RESUMEN
En este trabajo se ha estudiado el veneno de la anemona de mar Phymanthea pluvia (Drayton, 1846) y de la tarántula
Grammostola rosea (Walckenaer, 1837) colectadas en San Bartolo y Matucana, Lima, Perú, respectivamente. El veneno de
anemona de mar fue obtenido mediante shock hipotónico y el de la tarántula se extrajo de los quelíceros y fue “diluido”
en solución salina. El análisis electroforético del veneno soluble mostró la presencia de bandas proteicas. Se midió la
actividad coagulante y fosfolipásica de ambos venenos. Se encontró actividad fosfolipásica mostrando un halo de difusión
de 2,76 cm para P. pluvia y 3,35 cm para G. rosea. La actividad coagulante, ensayada sobre plasma citratado humano
dio resultado positivo en P. pluvia coagulando el plasma en 10 min y en 16 min para G. rosea. Se concluye que tanto el
veneno soluble de P. pluvia como el de G. rosea tiene actividad fosfolipásica y coagulante.
Palabras clave: anémona de mar – coagulante – fosfolipasa – tarántula – veneno
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v17i2.3322
https://revistas.urp.edu.pe/index.php/Biotempo
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Yafac-Piedra & Garcia-Alayo
260
INTRODUCCIÓN
Los cnidarios son un lo que agrupa alrededor de
10.000 especies de animales relativamente simples,
que viven exclusivamente en ambientes acuáticos,
mayoritariamente marinos, y representan una promisoria
fuente de potenciales fármacos. Los celenterados
producen proteínas y péptidos biológicamente activos,
incluidas toxinas formadoras de poros (citolisinas),
fosfolipasas, inhibidores de proteinasas y neurotoxinas.
Se han reportado que sus toxinas contienen propiedades
antitumorales, anti parasítica, antimicrobiana y otras
actividades debido a su poderosa acción membrano-lítica,
y a la posibilidad de dirigir estas proteínas y péptidos
hacia tejidos especícos (Córdoba-Chávez et al., 2017).
Por otro lado, se ha reportado que el veneno de tarántulas
contiene varios péptidos pequeños que pueden controlar
las propiedades de activación de una amplia gama de
canales iónicos con alta anidad y especicidad siendo
estos responsables de la coordinación y el control de
muchas funciones corporales, como la transducción
de señales en funciones sensoriales, contracciones del
músculo liso y también sirven como sensores en la
regulación del volumen (Polido et al., 2019). También
se sabe que venenos de estas especies poseen actividad
coagulante, siendo así un tema de investigación con
la esperanza de que puedan usarse como terapéutica
biomédica (Gutiérrez et al., 2016).
Las fosfolipasas A2 (FLA2) forman una familia de enzimas
claves en el recambio de los fosfolípidos de membranas
y en la generación de diversas sustancias bioactivas:
lisofosolípidos, ácidos grasos libres y mediadores lipídicos
de la inamación. Son responsables de la movilización
de ácidos grasos poliinsaturados liberados desde la
posición Sn2 de los glicerofosfolípidos, lo cual incluye
el ácido araquidónico (AA). El metabolismo del ácido
araquidónico puede seguir su metabolismo en múltiples
e interrelacionadas rutas, promoviendo la generación
y la liberación de una amplia variedad de sustancias
biológicamente activas (Valdés-Rodríguez et al., 2002).
Los componentes de los venenos son toxinas de
naturaleza proteica que suelen tener actividad sobre los
canales iónicos, actividad antibacteriana, antimicótica,
procoagulante, curarizante, anticancerígena y pueden
actuar de forma diversa sobre el sistema inmune (D’Suze et
al., 2014). Los principales componentes de los venenos que
presentan actividad coagulante son: (a) serinproteinasas
que convierten el brinógeno en brina (denominadas
enzimas ‘tipo trombina’); (b) serinproteinasas que activan
la protrombina; (c) metaloproteinasas dependientes de
zinc que activan la protrombina; (d) metaloproteinasas
que activan el factor X de la cascada de coagulación; y
(e) serinproteinasas que activan el factor V de la cascada
de coagulación (Markland, 1998). La determinación
de la actividad coagulante de los venenos se basa en la
adición de soluciones de veneno a muestras de plasma
que contienen citrato de sodio como anticoagulante
(Gutiérrez et al., 2016).
En el Perú solamente el veneno de Anthothoe chilensis
(Lesson, 1830) ha sido estudiado parcialmente (Quiroz-
Garrido, 2005; Retuerto et al., 2007; Landucci et al., 2012)
al igual que el de Phymactis papillosa(Lesson, 1830) (Cuya &
Escobar, 2017), sin obtenerse más información sobre venenos
en otras especies de anemonas disponibles en nuestro país.
El presente trabajo planteó como objetivo evaluar la
actividad coagulante y de fosfolipasa A2 del veneno de
la anémona de mar Phymanthea pluvia (Drayton, 1846)
y de la tarántula Grammostola rosea (Walckenaer, 1837)
MATERIALES Y METODOS
Material biológico
Siete ejemplares de P. pluvia fueron recolectadas de
la playa San Bartolo, Lima, Perú (12°23’29,4”S;
76°46’45,4”W). Los ejemplares colectados fueron
colocados en un contenedor con agua de mar y trasladados
inmediatamente al laboratorio.
El ejemplar G. rosea fue recolectado de Matucana, Lima,
Perú (11°50’26,4”S; 76°22’43,1”W) poniéndola en un
contenedor con sustrato de coco a 70% de humedad
para evitar su estrés. Posteriormente, fue trasladada
inmediatamente al laboratorio.
Extracción del veneno
Para la obtención del veneno de P. pluvia, siete ejemplares
se sometieron por shock hipotónico, para lo cual, estos
se colocaron en un beaker con 30 mL de agua destilada
durante 60 min (Figura 1). Luego el material fue ltrado en
papel Whatman 2,0 y posteriormente centrifugado a 12000
rpm por 30 min obteniéndose el veneno crudo soluble.
Para la obtención del veneno de G. rosea, el ejemplar fue
adormecido con cloroformo para posteriormente extraer
sus quelíceros. Luego, ambos quelíceros fueron diluidos
con ayuda de un mortero en solución salina 0,9%.
Posteriormente se centrifugó a 12.000 rpm por 30 min
obteniéndose el veneno crudo soluble.
Coagulant and phospholipase A2 activity of two species
261
Prueba rápida de Biuret
Se tomaron 100 ul de cada veneno y se trasladó a un tubo
eppendorf, se agregó 1 gota del reactivo de Biuret para
evidenciar la presencia de proteínas. El viraje de color azul
a violeta comprobó el resultado positivo para la presencia
de proteínas.
Cuanti cación de proteínas
Para estimar la cantidad de proteína en el veneno soluble,
se utilizó tres concentraciones distintas del veneno
agregando a cada uno de estos 1 mL de reactivo de Biuret.
Se midió la absorbancia a 545 nm.
Electroforesis PAGE-SDS
Se preparó un gel de poliacrilamida al 15% siendo las
muestras preparadas bajo condiciones reductoras. La
corrida electroforética se realizó por 1 h a 100 voltios.
Luego el gel fue tenido con azul brillante de Coomassie
0,1% por 20 min, para luego ser decolorado hasta
evidenciar las bandas proteicas.
Prueba de actividad de la fosfolipasa A2
Se empleó el método de Habermann & Hardt (1972)
que mide la formación de un halo claro producto de la
hidrólisis de la lecitina por la Fosfolipasa. Se preparó agar
Mueller Hinton agregando emulsión de yema de huevo al
85% a una temperatura de 50°. Luego, se homogenizó la
mezcla y se repartió en placas. Después de la geli cación
se agregaron discos de difusión asépticos de 3mm de
diámetro para luego adicionarle en ellos el veneno crudo,
se utilizó agua destilada en una placa como control.
La placa control y las placas conteniendo veneno, se
incubaron a 37°C por tiempos relativos de 5 h, 10 h y 18
h, midiéndose a continuación con un Vernier, el diámetro
(mm) del halo. Para la evaluación de los resultados en
placa se aplicó análisis de regresión lineal, considerándose
como válidas aquellas concentraciones en donde el
coe ciente de determinación R2 sea igual o superior a
0,90.
Prueba de actividad coagulante
Se siguió el método descrito por Gutiérrez et al. (2016),
usando plasma humano citratado, para ellos se extrajo
sangre humana en un tubo con citrato de sodio al 3,2%,
este se centrifugó por 10 min a 3500 rpm, obteniéndose
la fracción sobrenadante correspondiente. Para los
ensayos, se preincubó 0,2mL del plasma por 10 min a
37°C para posteriormente agregar 0,1mL del veneno
e inmediatamente medir el tiempo en minutos en que
coagula el plasma.
Figura 1. Extracción de veneno de Phymanthea pluvia por shock hipotónico.
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Yafac-Piedra & Garcia-Alayo
262
Aspectos éticos
Los especímenes son especies de vida libre y no se
encuentran en peligro de extinción. A ambos se les
proporcionó un entorno adecuado, así como alimentación
y cuidados para preservar su salud y bienestar. Los autores
declaran que se cumplió con toda la normatividad
ética del país.
RESULTADOS
Prueba rápida de Biuret
La prueba rápida con el reactivo de Biuret resultó ser
positivo para el veneno de G. rosea, virando el color azul a
violeta. En cambio, para P. pluvia no hubo viraje de color
(Figura 2).
Figura 2. Prueba rápida de Biuret. A. Veneno soluble; B. Resultado negativo para Phymanthea pluvia; C. Resultado
positivo para Grammostola rosea.
Cuanti cación de proteínas
Tabla 1. Absorbancia (545nm) de concentraciones del veneno soluble de Phymanthea pluvia y Grammostola rosea
utilizando como blanco el reactivo de Biuret.
Phymanthea pluvia Grammostola rosea
Concentración (%) Absorbancia (Abs) 545nm
50 0,004 0,009
75 0,062 0,096
100 0,128 0,172
Figura 3. Per l de cuanti cación de proteínas del veneno soluble de Phymanthea pluvia y Grammostola rosea
medido a 545 nm.
A. B. C.
,
,
,
,
,
,
Coagulant and phospholipase A2 activity of two species
263
Electroforesis PAGE-SDS
Figura 4. PAGE – SDS del veneno soluble de:
A. Grammostola rosea; B. Phymanthea pluvia. Observándose 5 y 4 bandas proteicas respectivamente
Prueba de actividad de la fosfolipasa A2
Se observó un aumento progresivo del halo de hidrólisis
hasta las 18 h. de incubación, midiendo un máximo
de 6,01 cm y 5,04 cm para P: pluvia y G. rosea
respectivamente.
Tabla 2. Mediciones del halo de hidrolisis de Phymanthea pluvia y
Grammostola rosea en tiempos de incubación relativos.
Phymanthea pluvia Grammostola rosea
Tiempo de incubación (h) Halo de hidrólisis (cm)
5 1,33 1,44
10 2,76 3,35
18 6,01 5,04
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Yafac-Piedra & Garcia-Alayo
264
Figura 5. Halo de hidrolisis de la lecitina por acción de Fosfolipasa A2.
A. Control con agua destilada; B. 5 h, Phymanthea pluvia; C. 10, P. pluvia; D. 18 h P. pluvia;
E. 5 h, Grammostola rosea; F.10 h, G. rosea; G. 18 h, G. rosea.
Figura 6. Curva de la actividad fosfolipásica A2 en Grammostola rosea y Phymanthea pluvia con
análisis de regresión lineal (R2 ≥ 0,90).
, ,
,
, ,
,
Coagulant and phospholipase A2 activity of two species
265
Prueba de actividad coagulante
El veneno soluble de P. pluvia y G. rosea fue capaz de
coagular el plasma humano citratado en 10 min y 13 min
respectivamente.
Figura 7. Pruebas de coagulación. A. Actividad coagulante positivo en Grammostola rosea; B. Plasma citratado;
C. Actividad coagulante positivo en Phymanthea pluvia; D. Coagulo.
DISCUSIÓN
Cuya & Escobar (2017) obtuvieron el veneno de P.
papillosa por shock hipotónico por 60 min, siendo luego
ltrado y centrifugado. En esta investigación se siguió
el mismo protocolo y se obtuvo el veneno soluble de la
especie P. pluvia.
En la prueba rápida de Biuret, solo para P. pluvia resultó
negativo esto puede deberse a que las cantidades de
polipéptidos y proteínas sean muy mínimas y por ende la
prueba de Biuret no logró ser efectiva.
Se conoce que en otros estudios se han determinado la
actividad fosfolipásica mediante el métodoturbidimétrico
de Marinetti (1965), utilizando una solución de yema de
huevo al 2% en buer Tris-HCl 50 mM, incubándolo
y midiendo el tiempo de retraso de coagulación de la
solución a 100 °C. En esta investigación se aplicó el
método de Habermann & Hardt (1972) midiendo
la formación del halo producto de la hidrólisis de la
lecitinaen placa con agar y yema de huevo. Se obtuvieron
así mediciones de 3,03 cm como promedio para P. pluvia
y, un promedio de 3,27 cm para G. rosea, con coeciente
de determinación (R2) >0,90, lo cual permite considerar
estos datos como válidos y corroborativos
Los péptidos y proteínas son los componentes más
destacados de varias clases de toxinas de anemonas que han
sido aisladas y caracterizadas. Béress (1982) determinó el
rango de peso molecular de proteínas de anemona de mar,
siendo estas de 3 a 300 kDa. Entre estas se encontraron
polipéptidos de bajo peso molecular (2-8 kDa) con
actividad neurotóxica (Norton, 1991); polipéptidos con
peso molecular entre 10 y 25 kDa teniendo estos enzimas
como la hemolisina (Anderluh et al., 2000) y proteínas
con peso molecular entre 40 y 80 kDa con actividad
fosfolipásica (Hessinger & Lenho, 1974; Grotendorst
& Hessinger, 1999). Siguiendo estos patrones, Quiroz-
Garrido (2005) obtuvo resultados de PAGE-SDS con
bandas de 94 kDa a 14,4 KDa para la especie A. chilensis.
Teniendo estos datos, es posible comparar los pesos
moleculares con la especie P. pluvia, es por ello que se
recomienda utilizar patrones y estándares moleculares
para la determinación de los pesos moleculares.
Un estudio en Grammostola rosea (Walckenaer, 1837) por
Laino et al (2011), determinó proteínas de peso molecular
68 kDa y otras dos de 99 y 121 kDa, con una banda
predominante de 93 kDa, y otra minoría de 249 kDa
en una corrida electroforética; para el caso de G. rosea
se obtuvieron cinco bandas proteicas las cuales se podría
comparar con los resultados de este autor.
Gutiérrez et al. (2016) arman que la dosis coagulante
mínima puede expresarse como la cantidad absoluta de
veneno, o bien como la concentración de veneno una
vez agregado al plasma o al brinógeno. Se debe tener
presente que la actividad coagulante de los venenos varía
de acuerdo con la especie de origen del plasma (Suchyna
et al., 2000; Clement et al., 2007). Por su relevancia
clínica, recomienda utilizar plasma humano. En este caso,
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Yafac-Piedra & Garcia-Alayo
266
Scorpionism and dangerous scorpion species in
Venezuela. En: Springer Handbooks of Toxicology.
Scorpion Venoms. Gopalakrishnakone, P. (Ed).
Springer Verlag: Heidelberg, Germany.
Habermann, E. & Hardt, K.L. 1972. A sensitive and
specic plate test for the quantitation of
phospholipase. Analytical Biochemistry, 50:
163-173.
Hessinger, D. & Lenho, H.M. 1974. Degradation of red
cell membrane phospholipids by sea anemone
nematocyst venoms. Toxicon, 12: 379–383.
Laino, A.; Cunningham, M.; Heras, H. & García, F.
2011. In Vitro lipid transfer between lipoproteins
and midgut-diverticula in the spider Polybetes
pythagoricus. Comparative Biochemistry and
Physiology Part B: Biochemistry and Molecular
Biology, 160: 181-186.
Gutiérrez, J. M.; Rucavado, A.; Solano, G.; Lomonte,
B.; Herrera, M.; Segura, Á. & León, G. 2016.
Estrategias y Avances en el estudio de toxinas de
interés para la Biomedicina. Puebla, México:
Dirección Fomento Ed. 1: 19-40.
Grotendorst, G. & Hessinger, D. 1999. Purication and
partial characterization of the phospholipase A2
and co-lytic factor from sea anemone (Aiptasia
pallida) nematocyst venom. Toxicon, 37: 1779-
1796.
Landucci, E.; Dias, Q.; Marangoni, F.; Vilca-Quispe,
A.; Valeriano-Zapana, J.; Torres-Huaco, F.;
Martins-de-Souza, D.; Marangoni, S. & Ponce-
Soto, L. 2012. Purication and inammatory
edema induced by two PLA2 (Anch TX-I and
Anch TX-II) from sea anemone Anthothoe
chilensis (Actiniaria: Sagartiidae). Comparative
Biochemistry & Physiology B Biochemistry &
Molecular Biology, 161: 170-177.
Marinetti, G. 1965. e action of phospholipase A on
lipoproteins. Biochimica et Biophysica Acta, 98:
554-565.
Markland, F.S. 1988. Fibrin(ogen)olytic enzymes from
snake venoms. In: Pirkle, H. & Markland Jr.,
F.S. (Eds.). Hemostasis and Animal Venoms.
Marcel Dekker, New York, pp. 149-172.
Norton, R.S. 1991. Structure and structure-function
relationships of sea anemone proteins that
interact with the sodium channel. Toxicon, 29:
1051-1084.
se utilizó plasma humano con 3,2% de citrato de sodio,
obteniéndose un tiempo de coagulación de 10 min del
veneno de P. pluvia y 13 min del veneno de G. rosea.
De esta manera podemos corroborar la importancia de
especies marinas como su diversidad, ya que estas no son
actualmente estudiadas; al igual que especies de la familia
de los Terafósidos y con sus propiedades coagulantes
poder realizar estudios especializados en un futuro para
la mejora de la calidad de vida humana.
El veneno de la anemona P. pluvia y de la tarántula G.
rosea tienen actividad fosfolipásica y coagulante. P. pluvia
causó una mayor hidrólisis a comparación de G. rosea,
provocando un halo con un máximo de 6,01cm. G. rosea
obtuvo un tiempo mayor de coagulación siendo de 13
min y P. pluvia de 10 min. Se comprobó la presencia
de proteínas en P. pluvia en la corrida de electroforesis
PAGE – SDS.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Anderluh, G.; Podlesek, Z. & Macek, P. 2000. A
common motif in proparts of Cnidarian toxins
and nematocyst collagens and its putative role.
Biochimica et Biophysica Acta, 1476: 372–376.
Béress, L. 1982. Biologically active compounds from
coelenterates. Pure and Applied Chemistry, 54:
1981–1994.
Cuya, A. & Escobar, E. 2017. Estudio bioquímico
del veneno de la anémona de mar Phymactis
papillosa (Actiniidae). Revista peruana de
biología,24: 303-310.
Córdoba-Chávez, A.; Borbón-Alpízar, H.; Alvarado-
Mesén, J.; Zamora-Rodríguez, M.; Soto-Fallas,
R.M. & Abrego-Ramírez, D. 2017. Actividad
hemolítica de la Anémona Marina Aiptasia
Pallida (Cnidaria: Actiniaria: Actiniidae) de
Costa Rica.Revista Tecnología en Marcha,30:
97-105.
Clement, H.; Odell, G.; Zamudio, F.Z.; Redaelli, E.;
Wanke, E.; Alagón, A. & Possani, L.D. 2007.
Isolation and characterization of a novel toxin
from the venom of the spider Grammostola rosea
that blocks sodium channels.Toxicon,50: 65-
74.
D’Suze, G., Castillo, C., Sevcik, C., Brazón, J.,
Malave, C., Hernandez, D., Zerpa, N., 2014.
Coagulant and phospholipase A2 activity of two species
267
Polido, G.; Shi, X.; Xu, D.; Guo, C.; ai, R.; Patterson,
J.P. & Holland, G.P. 2019. Investigating
the interaction of Grammostola rosea venom
peptides and model lipid bilayers with
solid-state NMR and electron microscopy
techniques. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Biomembranes,1861: 151-160.
Quiroz-Garrido, Y.M. 2005. Estudio de las toxinas de
la anémona de mar Anthothoe chilensis (Lesson,
1830) (Actiniaria: Sagartiidae). Tesis EP
Ciencias Biológicas. Universidad Nacional
Mayor de San Marcos. https://hdl.handle.
net/20.500.12672/1404
Retuerto, F.; Arbaiza, E.; Quiroz-Garrido, Y.; Estrada,
R. & Zavala, J. 2007. Actividad biológica del
veneno de Anthothoe chilensis (Lesson, 1830)
(Actiniaria: Sagartiidae). Revista Peruana de
Biología,14: 277-282.
Suchyna, T. M.; Johnson, J.H.; Hamer, K.; Leykam,
J.F.; Gage, D.A.; Clemo, H.F. & Sachs, F.
2000. Identication of a peptide toxin from
Grammostola spatulata spider venom that blocks
cation-selective stretch-activated channels.e
Journal of general physiology,115: 583-598.
Valdés-Rodríguez, Y.C.; Bilbao-Díaz, M.; León-
Álvarez, J.L. & Merchán- González, F. 2002.
Origen e importancia de la fosfolipasa A2 de
secreción. Revista Cubana de Farmacia, 36:
121-128.
Received August 30, 2020.
Accepted October 7, 2020.
