Insects associated with chromatic traps in lettuce
79
ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2023, 20(1), jan-jun.: 79-84.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
COMPARISON OF INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE AND ELISA FOR
THE DIAGNOSIS OF NEOSPORA CANINUM DUBEY, CARPENTER, SPEER,
TOPPER & UGGLA, 1988 IN ALPACAS
COMPARACIÓN DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Y ELISA PARA
EL DIAGNÓSTICO DE NEOSPORA CANINUM DUBEY, CARPENTER, SPEER,
TOPPER & UGGLA, 1988 EN ALPACAS
Enrique Serrano-Martínez1,*; Elizabeth Hinostroza Meza1; Marco Quispe Huacho1;
Guillermo Leguía Puente2 & César Burga Cisterna1
1 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia – Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.
2 Escuela de Ciencias Veterinarias, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú.
* Corresponding autor: enrique.serrano@upch.pe
Enrique Serrano-Martínez: https://orcid.org/0000-0002-4452-2666
Elizabeth Hinostroza-Meza: https://orcid.org/0000-0002-7758-2630
Marco Quispe-Huacho: https://orcid.org/0000-0002-1194-0685
Guillermo Leguía-Puente: https://orcid.org/0000-0002-8787-6595
César Burga-Cisterna: https://orcid.org/0000-0002-2373-845X
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v20i1.5630
https://revistas.urp.edu.pe/index.php/Biotempo
ABSTRACT
is study aimed to compare the techniques of indirect Immunofl uorescence Antibody Test (IFAT) and Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) techniques for the diagnosis of Neospora caninum Dubey, Carpenter, Speer, Topper &
Uggla, 1988 in alpacas from the highlands of Peru. Sensitivity, specifi city, positive predictive value, negative predictive
value, and concordance of IFAT were evaluated using a commercial competitive ELISA kit (cELISA - VMRD) as a
reference. 1540 sera samples were collected from alpacas naturally exposed to N. caninum. e results showed good
sensitivity (92.95%), high specifi city (99.75%), a positive predictive value of 92.90%, and a negative predictive value of
99.04%. e concordance between both diagnostic techniques (IFAT and ELISA) turned out to be almost perfect (k =
0.98). It is concluded that the IFAT test has a high effi ciency for the diagnosis of N. caninum in alpacas.
Keywords: alpaca – concordance – IFAT – Neosporosis– sensitivity – specifi city
RESUMEN
El objetivo del estudio fue comparar las técnicas de inmunofl uorescencia indirecta (IFI) y Ensayo de inmunoadsorción
ligado a enzima (ELISA) para el diagnóstico de Neospora caninum Dubey, Carpenter, Speer, Topper & Uggla, 1988 en
Este artículo es publicado por la revista Biotempo de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso
abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/
by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.
Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma
(FCB-URP)
Revista Biotempo
i
lat ndex
Catalogo
2.0
Volumen 20 (1) Enero-Junio 2023
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Serrano-Martínez et al.
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alpacas de la sierra del Perú. Se evaluó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo
y concordancia de IFI usando de referencia un kit comercial de ELISA competitivo (cELISA - VMRD). Se obtuvieron
1540 muestras de sueros de alpacas expuestas naturalmente a N. caninum. Los resultados muestran una buena sensibilidad
(92,95%), alta especificidad (99,75%), valor predictivo positivo de 92,90% y un valor predictivo negativo de 99,04%.
La concordancia entre ambas técnicas diagnósticas (IFI y ELISA) resultó ser casi perfecta (k=0,98). Se concluye que la
prueba de IFI tiene un alto desempeño para el diagnóstico de N. caninum en alpacas.
Palabras clave: alpaca – concordancia – IFI – Neosporosis – sensibilidad – especificidad
INTRODUCCIÓN
La neosporosis es una enfermedad generada por el
protozoo Neospora caninum Dubey, Carpenter, Speer,
Topper & Uggla, 1988 (Dubey et al., 1988) que ocasiona
importantes pérdidas económicas por problemas
reproductivos (Chi et al., 2002; Dubey et al., 2007;
Moore et al., 2013). Afecta a una gran variedad de
animales y es considerada la principal causa de abortos
en el ganado (Dubey, 2003; Cabral et al., 2009; Bishop
et al., 2010; Jara et al., 2011; Varaschin et al., 2012). Esta
enfermedad también afecta a los camélidos sudamericanos
como las alpacas causando abortos (Chávez-Velásquez et
al., 2004; Serrano-Martínez et al., 2004), reduciendo su
productividad y perjudicando a los criadores campesinos
de bajos recursos que se benefician de su fibra y carne
(Vargas-Terán, 2005; Serrano-Martinez et al., 2007).
El diagnóstico de la neosporosis es indispensable para su
prevención y control. En la actualidad se han desarrollado
diversas técnicas diagnósticas como Inmnoblot, Western
blot, ELISA, inmunofluorescencia indirecta (IFI)
y aglutinación directa (Soler et al., 2022). Entre las
pruebas más usadas se encuentra el ELISA, que permite
un rápido y sencillo análisis de las muestras. IFI fue la
primera técnica serológica aplicada en el diagnóstico de
neosporosis (Atkinson et al., 2000; Ortega-Mora et al.,
2006; Campero et al., 2015, Campero et al., 2018). Sin
embargo, la eficiencia de estas técnicas fue evaluada en
especies bovinas, ovinas y caprinas, no existiendo en la
actualidad una prueba diagnóstica evaluada específica en
camélidos sudamericanos.
El actual desarrollo de tecnologías específicas para
camélidos sudamericanos permite el mejoramiento en
el diagnóstico de N. caninum en estas especies (Serrano-
Martínez et al., 2007). La creación de anticuerpos contra
IgG de llama (cadena pesada y ligera) hechos a base
anticuerpos de cabra, permite una gran versatilidad de
aplicación en diversas pruebas diagnósticas como ELISA,
Western Blot e inmunofluorescencia (Anaya et al., 2008).
El uso de los anticuerpos específicos anti-IgG de llama
permite realizar una prueba de IFI más específica en
comparación a otras pruebas diagnósticas con anticuerpos
anti IgG para otras especies (Daley et al., 2005).
Por esta razón, el estudio buscó comparar las técnicas
serológicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y
ELISA para el diagnóstico de N. caninum en alpacas,
evaluando su concordancia en el desempeño diagnóstico,
con la finalidad de tener una herramienta alternativa para
su diagnóstico y control.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras
Se colectaron 1540 muestras de sueros de alpacas de las
comunidades campesinas y empresas ganaderas del Perú de
la Sierra Central de Junín y Huancavelica principalmen-
te en INIA (Instituto Nacional de Innovación Agraria) de
Huancayo y Lachocc de la Universidad de Huancavelica; y
Sierra Sur de Cusco y Puno principalmente IVITA ( Insti-
tuto Veterinario de Investigaciones Tropicales y de Altura).
La Raya del Distrito de Marangani y Quinsachata en dis-
trito de Nuñoa/Melgar, colectando 385 muestras de cada
provincia. Las muestras fueron colectadas entre noviembre
de 2016 y diciembre de 2017. Los animales estuvieron bajo
un sistema de crianza semi-intensiva. Todas las muestras de
sangre fueron obtenidas por punción de la vena yugular
y procesadas en el Laboratorio de Parasitología Animal de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FAVEZ)
de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH) en
Lima
.
Detección de Anticuerpos
Por ELISA
Para determinar la presencia de anticuerpos frente a N.
caninum se utilizó un kit comercial (Neospora caninum
IFI for the diagnosis of Neospora Caninum
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Ab Test Kit cELISA, Veterinary Medical Research
& Development-VMRD, EEUU), siguiendo las
indicaciones del fabricante. Este producto tiene una alta
sensibilidad (96,4%) y especificidad (96,8%) (Baszler et
al., 2001). Los valores de la densidad óptica se midieron
usando un espectrofotómetro de 650 nm.
Por IFI
Se utilizó la técnica IFI para la detección de anticuerpos
específicos de N. caninum en suero sanguíneo de alpacas,
descrita inicialmente por Trees (Trees et al., 1993) y
optimizada en el Laboratorio de Parasitología Animal
de FAVEZ-UPCH. Como antígeno se utilizaron
taquizoítos (107/ml) de la cepa NcSp1 donados por el
grupo “SALUVET” de la Universidad Complutense
de Madrid y reproducidos mediante cultivo de células
Vero. El antisuero policlonal usado fue anti-IgG de llama
conjugado con isotiocianato de fluoresceína (VMRD) en
una dilución de 1:100 (Chávez-Velásquez et al., 2004).
Se consideró como muestra positiva la observación de
la fluorescencia total del taquizoíto y como muestra
negativa la falta de fluorescencia o fluorescencia parcial
(Paré et al., 1995).
Análisis de Datos
Se estimó la sensibilidad (S), especificidad (E), valor
predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo
(VPN) de IFI usando como referencia la prueba
diagnóstica de cELISA, considerando que no existe
la prueba “gold standard” para el diagnóstico de N.
caninum en camélidos sudamericanos. El análisis de
concordancia se realizó mediante el coeficiente de Kappa
de Cohen con un nivel de significancia de 0,05 (Cantor,
1996). El desempeño de la prueba (S, E, VPP, VPN) y
la concordancia fueron evaluados usando el software
STATA 15 (StataCorp; College Station, TX).
RESULTADOS
La prueba de IFI, usando como prueba gold standard
a cELISA-VMRD registró un alto desempeño para el
diagnóstico de anticuerpos contra N. caninum, mostrando
una sensibilidad de 92,90%, especificidad de 98,75%,
valor predictivo positivo de 90,91% y un valor predictivo
negativo de 99,04% (Tabla 1).
Tabla 1. Resultados del desempeño de la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) usando como referencia cELISA-
VMRD para el diagnóstico serológico de inmunoglobulina G contra Neospora caninum en alpacas.
Técnica Sensibilidad (%) (95%
IC)
Especificidad (%)
(95% IC)
Valor predictivo
positivo (%)
(95% IC)
Valor predictivo negativo
(%)
(95% IC)
ELISA - - - -
IFI 92,9 (92,8-93.0) 98,8 (98,7-98,8) 90,9 (90,7-91,1) 99.0 (98,9-99,5)
Tabla 2. Resultados del diagnóstico serológico de inmunoglobulina G contra Neospora caninum en alpacas con las
pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y cELISA-VMRD.
cELISA IFI Total
Positivo Negativo
Positivo 170 13 183
Negativo 17 1340 1357
Total 187 1353 1540
(Kappa=0,98).
Los métodos diagnósticos de IFI y cELISA tienen una
concordancia casi perfecta para determinar la presencia
de anticuerpos contra N. caninum en alpacas, obteniendo
un alto índice de Kappa (0,98) (Tabla 2).
DISCUSIÓN
La prueba de IFI demostró muy buen desempeño
diagnóstico similar a la de ELISA como prueba diagnóstica
de N. caninum. A pesar de que una de sus principales
limitaciones es la subjetividad y el consumo de tiempo en
el análisis, esta prueba sigue siendo ampliamente utilizada
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a nivel mundial y es considerada como prueba “gold
estandard” (Atkinson et al., 2000, Soler et al., 2022).
El punto de corte de las diluciones a usar en la prueba
de IFI es un tema de constante debate. Diversos estudios
muestran óptimos puntos de corte que varían entre
1:100 a 1:640 para bovinos adultos y 1:16 a 1:80 para
serología fetal (Björkman & Uggla, 1999; Álvarez-García
et al., 2003). Sin embargo, diluciones menores a 1:100
realizados en alpacas y llamas detectan anticuerpos no
específicos y a partir de 1:100 los anticuerpos detectados
son específicos (Chávez-Velásquez et al., 2004). Este
punto de corte permite mejorar la eficiencia de IFI en el
diagnóstico de anticuerpos contra N. caninum en alpacas
evitando reacciones cruzadas con otros apicomplexos
(Gondim et al., 2017).
Los altos niveles de especificidad alcanzados en la prueba
de IFI sugieren que esta prueba puede ser utilizada como
prueba confirmatoria. Esta alta especificidad es reflejada
en otros estudios donde encuentran una especificidad
más elevada que la sensibilidad (Atkinson et al., 2000).
Esto se asocia al criterio diagnóstico de la prueba, donde
la fluorescencia total del taquizoíto se considera como
positivo (Paré et al., 1995), necesitando una muestra
con altos títulos de anticuerpos para lograr su total
fluorescencia (Campero et al., 2018; Soler et al., 2022).
El tiempo de seroconversión de anticuerpos contra
N caninum es un factor para tomar en cuenta en la
presentación de falsos negativos. Los anticuerpos
conjugados usados en las pruebas serológicas tienen una
alta afinidad contra IgG anti-Neospora caninum (Baszler
et al., 2001; Tomassetti et al., 2013). Por otro lado,
en bovinos se conoce que la seroconversión es rápida,
logrando producir anticuerpos específicos a los nueve días
de la infección y alcanzando los títulos más altos a los 32
días (Conrad et al., 1993). Estos hallazgos sugieren que
la rápida seroconversión en bovinos se puede repetir en
los camélidos sudamericanos, reduciendo el número de
falsos negativos; sin embargo, se necesitan estudios para
evaluar esta semejanza.
A pesar de que el kit comercial de cELISA-VMDR usa
anticuerpos contra IgG bovino, logró obtener un alto nivel
de concordancia con la prueba de IFI que usa anticuerpos
anti-IgG de llama. Este alto nivel de concordancia no solo
se ve reflejado en alpacas, sino también en vicuñas, donde
se encuentra un valor Kappa de 0,85 (Pinedo et al.,
2014). Esta versatilidad de las pruebas diagnósticas entre
bovinos y camélidos sudamericanos se puede asociar a su
alta relación genética (Alawad et al., 2016), además que
ambos pertenecen a la orden de los Artiodactyla (Pachaly,
2001, Alawad et al., 2016).
Se concluye que la prueba diagnóstica de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectar
anticuerpos contra N. caninum muestra una alta eficiencia,
y que la concordancia diagnóstica es casi perfecta entre
las técnicas serológicas IFI y cELISA para la detección
de anticuerpos contra N. caninum en alpacas (k = 0,98).
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el financiamiento del estudio a
Cienciactiva del CONCYTEC por el apoyo financiero
brindado al proyecto “Obtención y caracterización
del primer aislado de Neospora caninum causante de
abortos en camélidos sudamericanos del Perú, con
fines inmunodiagnóstico y vacunal” (Contrato 220-
2015 FONDECYT–De), que permitió los análisis y la
capacitación técnica de los investigadores para la ejecución
del estudio. Del mismo modo, se agradece a los ganaderos
(empresas ganaderas y comunidades campesinas) y tesistas
que colaboraron durante la recolección de las muestras.
A Luis Miguel Ortega-Mora y al Grupo SALUVET de
la Universidad Complutense de Madrid, España, por la
donación de la cepa de Neospora caninum (NcSp1).
Author contributions: CRediT (Contributor Roles
Taxonomy)
ESM = Enrique Serrano-Martinez
EHM = Elizabeth Hinostroza Meza1
MQH = Marco Quispe Huacho
GLP = Guillermo Leguía Puente
CBC= César Burga Cisterna
Conceptualization: ESM
Data curation: ESM
Formal Analysis: CBC
Funding acquisition: ESM, GLP
Investigation: ESM
Methodology: ESM, MQH
Project administration: ESM
Resources: ESM
Software: ESM
Supervision: ESM, EHM
Validation: ESM, EHM
Visualization: ESM
Writing – original draft: ESM
Writing – review & editing: ESM
IFI for the diagnosis of Neospora Caninum
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