Insects associated with chromatic traps in lettuce
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ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2023, 20(1), jan-jun.: 35-42.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
DETERMINATION OF THE LC50 AND EVALUATION OF THE GENOTOXIC
ACTIVITY OF ARSENIC ON NUCLEATED ERYTHROCYTES FROM THE PE-
RIPHERAL BLOOD OF ZEBRAFISH (DANIO RERIO HAMILTON, 1822)
DETERMINACIÓN DEL CL
50
Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GE-
NOTÓXICA DEL ARSÉNICO SOBRE LOS ERITROCITOS NUCLEADOS DE LA
SANGRE PERIFÉRICA DEL PEZ CEBRA (DANIO RERIO HAMILTON, 1822)
Carlos Scotto1,2*, Ricardo Céspedes-Lizarraga1 & Hugo Medina-Gomez1
1 Laboratorio de Mejora Genética & Reproducción Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática. Universidad
Nacional Federico Villarreal. Jirón Río Chepén s/n. El Agustino. Lima. Perú. E-mail: cscotto@unfv.edu.pe
2 Módulo dulceacuícola de la Facultad de Ciencias de la Universidad Ricardo Palma. Lima. Perú.
* Corresponding author: cscotto@unfv.edu.pe
Carlos Scotto: https://orcid.org/0000-0003-1592-0419
Ricardo Céspedes-Lizárraga: https://orcid.org/0000-0001-7324-3423
Hugo Medina-Gómez: https://orcid.org/0000-0002-9076-6370
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v20i1.5632
https://revistas.urp.edu.pe/index.php/Biotempo
ABSTRACT
e importance of the zebrafi sh (Danio rerio Hamilton, 1822) as an animal model to understand how various biological
processes that occur due to genotoxicity is well known. In the present investigation, the LC50 (median lethal concentration)
was obtained in zebrafi sh for arsenic (As), which was 0.3mg.L-1. Peripheral blood was then used to visualize genotoxic
damage caused by As in nucleated erythrocytes using the comet assay. All types of comets were found according to the
As concentration, type 0 (without damage) in the control, and in the rest from LC50, all types of comets were present,
type 3 and 4 (severe damage) being more abundant. Concentrations 1/10, 1/5, and 1/2 of the LC50 showed comet types
1 and 2 more frequently, demonstrating the high sensitivity of the comet assay and the great versatility of an animal
model of the zebrafi sh.
Keywords: Arsenic – erythrocyte – genotoxic – LC50 – zebrafi sh
RESUMEN
Es conocida la importancia del pez cebra (Danio rerio, Hamilton, 1822) como animal modelo para entender cómo se
producen diversos procesos biológicos por genotoxicidad. En la presente investigación se obtuvo la CL50 (concentración
letal media) para el arsénico (As) que fue 0,3 mg.L-1. Luego se usó la sangre periférica para poder visualizar el daño
Este artículo es publicado por la revista Biotempo de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso
abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/
by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.
Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma
(FCB-URP)
Revista Biotempo
i
lat ndex
Catalogo
2.0
Volumen 20 (1) Enero-Junio 2023
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Scotto et al.
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genotóxico causado por el As en los eritrocitos nucleados mediante el ensayo cometa. Se encontraron todos los tipos
de cometas de acuerdo con la concentración de As, el tipo 0 (sin daño) en el control y en el resto desde la CL50 estaban
presentes todos los tipos de cometa, siendo más abundantes el tipo 3 y 4 (daño severo y grave). Las concentraciones 1/10,
1/5 y 1/2 de la CL50 se evidenció los tipos de cometa tipo 1 y 2 con mayor frecuencia demostrándose la alta sensibilidad
del ensayo cometa y la gran versatilidad como animal modelo del pez cebra.
Palabras clave: Arsénico – CL50 – eritrocito – genotóxico – pez cebra
INTRODUCCIÓN
El estudio en genotoxicidad que es la capacidad relativa
de un agente para causar efectos biológicos adversos al
dañar el ADN se suele usar a ratas y ratones para así
tener resultados más cercanos al ser humano (Gustavino
et al., 2001; Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado et
al., 2021); sin embargo, existen modelos animales que
recientemente se vienen utilizando para la investigación
científica como el pez Cebra (Danio rerio, Hamilton,
1822), que ha sido muy útil en la investigación de
diversos desordenes genéticos, metabólicos y hasta en
cancerogénesis, pero en genotoxicidad se ha vuelto
relevante por su gran versatilidad (Gustavino et al., 2001;
Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado et al., 2021).
Los peces son buenos bioindicadores porque dependen
de varios eslabones de la cadena trófica y son capaces de
acumular sustancias tóxicas y responden fácilmente a
bajas concentraciones de agentes mutagénicos (Gustavino
et al., 2001; Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado
et al., 2021). Esto producen alteraciones morfológicas
nucleares en eritrocitos y en otros tejidos y tipos celulares,
lo cual han sido utilizadas por diversos autores como
posibles indicadores de genotoxicidad (Da Silva-Souza &
Fontanetti et al, 2006; Tanguay, 2018; Cassar et al., 2019;
Canedo & Rocha, 2021). Una técnica muy utilizada
en la detección del daño en el ADN muy sensible es el
ensayo cometa que se ha utilizado en diversos modelos
animales, pero existe poca bibliografía sobre la utilización
de esta técnica en la sangre periférica en el pez cebra.
Actualmente el ensayo cometa ha sido aplicado con éxito
en los eritrocitos en una gran cantidad de especies de
peces, mostrando la sensibilidad de las células de la sangre
de estos animales a los efectos genotóxicos (Pandrangi et
al., 1995). También es conocido que en los estudios de
genotoxicidad in vivo se utilizan sustancias tóxicas con
efectos mutagénicos, como por ejemplo cobre, cadmio, y
arsénico, mercurio entre muchos otros (Cavas & Ergene-
Gözükara et al., 2005; Tanguay, 2018; Cassar et al., 2019;
Canedo & Rocha, 2021).
La presente investigación determinó la actividad ge-
notóxica del As en eritrocitos de la sangre periférica
utilizando como bioindicador al pez Cebra a diferentes
concentraciones y periodos de exposición. Y usándose la
técnica ensayo cometa se visualizó los efectos de la expo-
sición al As en diversas concentraciones por debajo de la
CL50, de esta manera la detección es relativamente rápida
y precisa gracias a la gran sensibilidad de dicha técnica
siendo posible visualizar los núcleos afectados a nivel del
ADN en la sangre de este pez.
MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se desarrolló entre enero y
noviembre del año 2019. Los peces fueron seleccionados
del stock de D. rerio pertenecientes al Laboratorio de
Mejora Genética y Reproducción Animal de la Facultad
de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad
Nacional Federico Villarreal en la ciudad de Lima, Perú.
Material biológico
Para el estudio se utilizaron un total de 50 especímen-
es de peces adultos de ambos sexos de diversos acuarios
de Lima Metropolitana y se aclimataron en condiciones
controladas del Laboratorio de Mejora Genética y Repro-
ducción Animal de la Facultad de Ciencias Naturales y
Matemática de la Universidad Nacional Federico Villar-
real, Lima, Perú.
Obtención de concentración letal media (CL50)
Se observó la supervivencia de un grupo de seis peces
en tres repeticiones y las de un grupo control del mismo
número durante 96 h usando las siguientes concentracio-
nes como se muestra en la figura 1 (Barch et al., 1997;
Ramírez & Mendoza, 2008; Scotto et al., 2019; Nava-Ri-
vera et al., 2021). Las soluciones de prueba en recipientes
de vidrio fueron añadidas y se registró la mortalidad a
las 96 h y finalmente se ingresaron los datos al programa
Genotoxic activity of arsenic
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estadístico Probit (STATGRAPHICS Centurion XVIII,
2016) para obtener la estimación de la CL50. Luego de
la obtención de la CL50 con los límites de confianza al
95% se usaron concentraciones por debajo de la CL50
fraccionadas al 1/2, 1/5, 1/10 con tres repeticiones más
su control como en la fig. 1 (Barch et al., 1997; Ramírez
& Mendoza, 2008; Scotto et al., 2019; Nava-Rivera et
al., 2021).
Figura 1. Esquema para determinar la CL50. A. Ensayo preliminar para determinar el posible CL50 del arsénico en el
pez cebra (Danio rerio) hasta las 96 h de exposición. B. Ensayo mostrando las repeticiones por cada concentración para
determinar el CL50 del arsénico realizado a las 24, 48, 72 y 96 h de exposición (Scotto et al., 2019).
Obtención de cometas
Con la finalidad de obtener los cometas se siguió un
protocolo ya estandarizado para el uso del ensayo cometa.
En un portaobjetos se formó una capa delgada de agarosa
de normal punto de fusión al 1,5% (Christofoletti et
al., 2009). En un “beaker” se vertió la agarosa líquida y
se sumergió el portaobjetos unas 25 a 30 veces dejando
un espacio de 30 seg en cada una y se deja secar a
temperatura ambiente por 1 ½ - 2 h y luego se aplica
sobre la primera capa la mezcla de 5 µL de sangre
periférica de D. rerio. con 85 µL de agarosa de bajo punto
de fusión al 0,5% (Christofoletti et al., 2009). Luego
se colocó un cubreobjetos sobre ella y llevar a 4 °C por
10 min. Pasado los 10 min se retiró del portaobjetos la
laminilla cubreobjetos y se agregó 85 µL de agarosa de
bajo punto de fusión 0,5% (Christofoletti et al., 2009),
se colocó una laminilla cubreobjetos y se llevó a 4 °C
por 10 min. Luego las láminas fueron cubiertas en una
solución de lisis constituida por 2,5M NaCl, 100mM
EDTA, 10mM Tris pH10, 20 ml DMSO y 1 ml Tritón
X-100 por 1h y media a 4°C en oscuridad. Al finalizar,
las láminas son extraídas y lavadas con una solución de
electroforesis; Dejándose secar. Después se colocaron las
láminas en una placa Petri con solución de denaturación
(NaOH 300mM y EDTA 1mM, pH 12) durante 20 min
en oscuridad y a 4°C, al término del tiempo las láminas
son puestas en la cámara electroforética oscura con
solución de electroforesis por 20 min, 21 V. y 270 mA.
Estas son lavadas con 3 ml de solución de neutralización:
0,4M Tris-HCl, pH 7,5 durante cinco min; dejándose
secar las láminas por 20 min. Se sumergen las láminas
en etanol absoluto por 10 min para fijar y al terminar el
tiempo se dejan secar por 20 min. La solución de 0,25
% de Nitrato de plata, 40 µL/100 mL de formaldehído
37% y agua destilada, penetra en la célula y tiñe el núcleo.
Las láminas fueron cubiertas con la solución de nitrato
de plata por 15 min hasta observar oscurecimiento de la
lámina. Luego fueron enjuagadas con agua destilada y se
dejaron secar por 20 min. Al observar en el microscopio
las células tienen apariencia de cometas con una cabeza en
la región nuclear y una cola que contiene los fragmentos o
roturas que migran en dirección del ánodo en las láminas.
Finalmente, estas fueron ser observadas a un aumento de
400x para su conteo y fotografiado.
Consideraciones éticas
Los experimentos se realizaron de acuerdo con todos los
protocolos de bioseguridad en el laboratorio de Genética y
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Reproducción animal de la Facultad de Ciencias Naturales
y Matemáticas de la UNFV dado por la ASOPEBAID
(2017). En el presente trabajo se empleó el principio de
las 3Rs. Estos principios han sido incorporados de una
manera responsable en las prácticas del presente trabajo.
Los peces vivos fueron mantenidos en un ambiente de
laboratorio con todas las medidas tomadas para un
normal desarrollo de los individuos. Las condiciones
ambientales fueron controladas en un sistema de soporte
total bajo una recirculación total del agua dulce (25-
28C°, pH 7), se usó una misma dieta ad libitum con
una iluminación de 14 h y control de la calidad de agua
(ºdH entre 3,35 y 4,2). Para el sacrificio se consideró una
concentración de 60 mg/L de la solución de eugenol en
el agua para ocasionar la muerte del animal a los 10 min
con la perdida completa de los reflejos e ingreso a estado
de inconciencia (Guía para el cuidado y uso de animales
de laboratorio, 2017).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El valor de la CL50 a 96 h (95% de límites de confianza)
fue 0,30 mg.L-1 en el pez Cebra. Y fue hallada mediante
el programa Probit (STATGRAPHICS Centurion XVIII,
2016). También se observaron los efectos de toxicidad en
D. rerio en las primeras 24 h de exposición y luego de las
48 h de exposición no hay más variaciones.
Las distintas concentraciones del arsénico se muestran en
la fig. 2 en la cual podemos destacar una relación del nivel
de daño y tipos de cometas acorde con la concentración
mostrando también unos resultados alentadores por el
nivel de sensibilidad de la técnica ensayo cometa que
permite exponer al D. rerio a muy bajas concentraciones
de exposición. Se desarrolló la tabla inversa de
predicciones con los porcentajes más relevantes con su
respectiva concentración con un límite de confianza de
la CL50 inferior a 95,0% y una CL50 superior a 95,0%.
Figura 2. Grafica del modelo ajustado con intervalos de confianza del 95% entre efecto y
concentración del arsénico en el pez cebra.
Figura 3. Modelo de regresión Probit para describir la relación entre porcentaje acumulado y
Concentración del arsénico en el pez cebra.
relevantes con su respectiva concentración con un límite de confianza de la CL50
inferior a 95,0% y una CL50 superior a 95,0%.
.
Grafica del modelo ajustado con intervalos de confianza del 95% entre efecto y concentración.
Modelo de regresión Probit para describir la relación entre porcentaje acumulado y
Concentración.
relevantes con su respectiva concentración con un límite de confianza de la CL50
inferior a 95,0% y una CL50 superior a 95,0%.
.
Grafica del modelo ajustado con intervalos de confianza del 95% entre efecto y concentración.
Modelo de regresión Probit para describir la relación entre porcentaje acumulado y
Concentración.
La CL50 del arsénico (0,30 mg.L-1) se diluyó a la mitad
(1/2), un quinto (1/5) y un décimo (1/10). La frecuencia
está relacionada al grado de toxicidad es decir de acuerdo
con la prevalencia de un tipo de cometa podemos
inferir la concentración a la que han sido expuestos los
eritrocitos del pez cebra, siendo la más frecuentes la del
tipo 4 en la concentración 0,30 mg.L-1 con un total de
41 cometas. Pero esta frecuencia del tipo 4 decrece a
Genotoxic activity of arsenic
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sólo 29 en la concentración de 0,15 mg.L-1, a 18 a 0,06
mg.L-1 y a 5 en 0,03 mg.L-1. El tipo 1 es más frecuente
entre las concentraciones 0,15 mg.L-1 y 0,03 mg.L-1. La
del tipo 2 resulto ser más abundante en la concentración
de 0,30 mg.L-1. Y la del tipo 3 fue más abundante en la
concentración 0,03 mg.L-1. Estos resultados se muestran
en la tabla 1.
Tabla 1. Tabla de Predicciones Inversas para Concentración del arsénico en el pez cebra.
Concentración
Tipo de cometa 0,30 mg.L-1 0,15 mg.L-1 0,06 mg.L-1 0, 03 mg.L-1 Control
0 21 18 13 26 8
1 14 22 24 23 4
2 15 10 8 7 0
3 13 8 5 19 0
4 41 29 18 5 0
Figura 4. Mortalidad en el pez cebra versus la concentración del arsénico expresada en mg.L-1.
mediante el análisis y observación en el microscopio
óptico en un aumento total de 400X.
La mortalidad de acuerdo con la concentración se
muestra desde las 24 a las 96 h de exposición teniendo
una tendencia muy regular luego de las 24 h (Fig. 4
Se utilizó la data en base de las cometas observadas en
cada concentración, para la cual, se sacrifi có un pez por
cada repetición, las búsquedas de cometas se realizaron
Figura 5. Categorización del daño en las cometas por el arsénico. Nivel de daño de acuerdo con la longitud de la cola:
0/ sin daño, 1/ daño leve, 2/daño moderado, 3/ daño alto, 4/daño grave, visualización de cometas
con fl uorescencia (Kumaravel et al., 2009).
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A continuación, se muestra fig. 6 el cual se muestra los
diferentes tipos de cometas encontradas en este trabajo,
así como el nivel de daño.
Figura 6. Cometas halladas con todos los niveles de daño por arsénico. (A) cometa tipo 0 abundante en el control y
no muestra daño, (B) Cometa tipo 1 el cual muestra un daño ligero, (C) Cometa tipo 2 con daño medio, (D) Cometa
tipo 3 con daño severo y (E) Cometa tipo 4 con daño grave y destrucción total del ADN.
La alta sensibilidad de los peces como modelo animal y
bioindicadores con una altísima capacidad de acumular
sustancias toxicas responden a muy bajas concentraciones
de las mismas (Gustavino et al., 2001), Además el daño
causado en los eritrocitos afecta otros tejidos como el
sistema nervioso que conlleva a efectos severos en el
comportamiento y la locomoción siendo indicadores
de genotoxicidad (Ergene et al., 2007; Tanguay, 2018;
Cassar et al., 2019; Canedo & Rocha, 2021).
En este estudio, se utilizó el pez cebra como un modelo
animal viable y alternativo en la exposición al As. El
estudio actual demostró el potencial de la exposición
al As para generar a nivel celular destrucción del ADN
de acuerdo con la concentración. Como resultado
pudimos comprobar que el efecto tóxico del As en los
eritrocitos era evidente de acuerdo con la concentración
de As siendo el daño mayor a nivel celular y esto se
fue evidenciando con los diversos tipos de cometas
encontrados. Los valores de CL50 encontrado en el pez
cebra fue de 0,30 mg.L-1. En relación con los tipos de
cometas encontrados, las frecuencias registradas entre
las 24 a 96 h de tratamiento con la concentración de
0,30 mg.L-1 fueron significativamente mayores para el
tipo 4 (daño grave) mostrando una destrucción total
del ADN. La mortalidad fue marcada directamente
por dos variables, la concentración y por el tiempo de
exposición obteniéndose que en concentraciones mayores
al 0,45 mg.L-1 todos los individuos morían a las 24 h.
Sin embargo, dicha mortalidad se reduce a medida que la
concentración disminuye. Luego de hallar la CL50 el cual
implica que es la concentración por la cual solo el 50%
de los individuos muere sin cambiar esta tendencia por el
tiempo de exposición.
La frecuencia está relacionada al grado de toxicidad
sugiere que está directamente relacionado a la
concentración, siendo los más frecuentes en el tipo 0 en el
grupo de control indicando que no hay daño alguno. En
el grupo expuesto a 0,30 mg.L-1, las células presentaron
una frecuencia mucho más alta de cometas del tipo 4
evidenciando un daño severo comprobando que nuestros
resultados son similares al de otros proyectos en el cual
se hallaron efectos similares en otros animales modelo
(Hallauer et al., 2016).
En el resto de las concentraciones se hallaron fases
intermedias observando los otros tipos de cometa 0, 2
y 3, evidenciando un daño a diversos niveles tal como
reportan otros trabajos no solamente con el efecto del
arsénico sino también estudios en los efectos de otras
sustancias. Al 1/10 de la CL50, es decir a 0,03 mg.L-1 es
más frecuente el tipo de cometa 0 pero se observaron
todos los niveles incluyendo el tipo 4 con una frecuencia
baja.
En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que la
técnica del ensayo cometa es altamente sensible para el
As y la gran versatilidad del pez cebra es muy útil para el
estudio y análisis con genotóxicos permitiendo ampliar el
conocimiento y entender el impacto en un organismo a
nivel celular.
Genotoxic activity of arsenic
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Author contributions: CRediT (Contributor Roles
Taxonomy)
CSE= Carlos Scotto Espinoza
RCL = Ricardo Céspedes Lizarraga
HMG = Hugo Medina Gomez
Conceptualization: CSE, RCL, HMG
Data curation: CSE, RCL
Formal Analysis: RCL, HMG
Funding acquisition: CSE, RCL, HMG
Investigation: CSE, RCL, HMG
Methodology: CSE, RCL, HMG
Project administration: CSE, RCL
Resources: CSE, RCL, HMG
Software: RCL, HMG
Supervision: CSE, RCL
Validation: CSE, RCL, HMG
Visualization: CSE, RCL, HMG
Writing – original draft: CSE, RCL
Writing – review & editing: CSE, RCL, HMG
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Received February 19, 2023.
Accepted April 10, 2023.
