Insects associated with chromatic traps in lettuce
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ISSN Versión impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2023, 20(1), jan-jun.: 35-42.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
DETERMINATION OF THE LC50 AND EVALUATION OF THE GENOTOXIC
ACTIVITY OF ARSENIC ON NUCLEATED ERYTHROCYTES FROM THE PE-
RIPHERAL BLOOD OF ZEBRAFISH (DANIO RERIO HAMILTON, 1822)
DETERMINACIÓN DEL CL
50
Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GE-
NOTÓXICA DEL ARSÉNICO SOBRE LOS ERITROCITOS NUCLEADOS DE LA
SANGRE PERIFÉRICA DEL PEZ CEBRA (DANIO RERIO HAMILTON, 1822)
Carlos Scotto1,2*, Ricardo Céspedes-Lizarraga1 & Hugo Medina-Gomez1
1 Laboratorio de Mejora Genética & Reproducción Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática. Universidad
Nacional Federico Villarreal. Jirón Río Chepén s/n. El Agustino. Lima. Perú. E-mail: cscotto@unfv.edu.pe
2 Módulo dulceacuícola de la Facultad de Ciencias de la Universidad Ricardo Palma. Lima. Perú.
* Corresponding author: cscotto@unfv.edu.pe
Carlos Scotto: https://orcid.org/0000-0003-1592-0419
Ricardo Céspedes-Lizárraga: https://orcid.org/0000-0001-7324-3423
Hugo Medina-Gómez: https://orcid.org/0000-0002-9076-6370
Biotempo (Lima)
doi:10.31381/biotempo.v20i1.5632
https://revistas.urp.edu.pe/index.php/Biotempo
ABSTRACT
e importance of the zebrafi sh (Danio rerio Hamilton, 1822) as an animal model to understand how various biological
processes that occur due to genotoxicity is well known. In the present investigation, the LC50 (median lethal concentration)
was obtained in zebrafi sh for arsenic (As), which was 0.3mg.L-1. Peripheral blood was then used to visualize genotoxic
damage caused by As in nucleated erythrocytes using the comet assay. All types of comets were found according to the
As concentration, type 0 (without damage) in the control, and in the rest from LC50, all types of comets were present,
type 3 and 4 (severe damage) being more abundant. Concentrations 1/10, 1/5, and 1/2 of the LC50 showed comet types
1 and 2 more frequently, demonstrating the high sensitivity of the comet assay and the great versatility of an animal
model of the zebrafi sh.
Keywords: Arsenic – erythrocyte – genotoxic – LC50 – zebrafi sh
RESUMEN
Es conocida la importancia del pez cebra (Danio rerio, Hamilton, 1822) como animal modelo para entender cómo se
producen diversos procesos biológicos por genotoxicidad. En la presente investigación se obtuvo la CL50 (concentración
letal media) para el arsénico (As) que fue 0,3 mg.L-1. Luego se usó la sangre periférica para poder visualizar el daño
Este artículo es publicado por la revista Biotempo de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso
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Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma
(FCB-URP)
Revista Biotempo
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Catalogo
2.0
Volumen 20 (1) Enero-Junio 2023
Revista Biotempo: ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697 Scotto et al.
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genotóxico causado por el As en los eritrocitos nucleados mediante el ensayo cometa. Se encontraron todos los tipos
de cometas de acuerdo con la concentración de As, el tipo 0 (sin daño) en el control y en el resto desde la CL50 estaban
presentes todos los tipos de cometa, siendo más abundantes el tipo 3 y 4 (daño severo y grave). Las concentraciones 1/10,
1/5 y 1/2 de la CL50 se evidenció los tipos de cometa tipo 1 y 2 con mayor frecuencia demostrándose la alta sensibilidad
del ensayo cometa y la gran versatilidad como animal modelo del pez cebra.
Palabras clave: Arsénico – CL50 – eritrocito – genotóxico – pez cebra
INTRODUCCIÓN
El estudio en genotoxicidad que es la capacidad relativa
de un agente para causar efectos biológicos adversos al
dañar el ADN se suele usar a ratas y ratones para así
tener resultados más cercanos al ser humano (Gustavino
et al., 2001; Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado et
al., 2021); sin embargo, existen modelos animales que
recientemente se vienen utilizando para la investigación
científica como el pez Cebra (Danio rerio, Hamilton,
1822), que ha sido muy útil en la investigación de
diversos desordenes genéticos, metabólicos y hasta en
cancerogénesis, pero en genotoxicidad se ha vuelto
relevante por su gran versatilidad (Gustavino et al., 2001;
Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado et al., 2021).
Los peces son buenos bioindicadores porque dependen
de varios eslabones de la cadena trófica y son capaces de
acumular sustancias tóxicas y responden fácilmente a
bajas concentraciones de agentes mutagénicos (Gustavino
et al., 2001; Hallauer et al., 2016; Guzmán-Delgado
et al., 2021). Esto producen alteraciones morfológicas
nucleares en eritrocitos y en otros tejidos y tipos celulares,
lo cual han sido utilizadas por diversos autores como
posibles indicadores de genotoxicidad (Da Silva-Souza &
Fontanetti et al, 2006; Tanguay, 2018; Cassar et al., 2019;
Canedo & Rocha, 2021). Una técnica muy utilizada
en la detección del daño en el ADN muy sensible es el
ensayo cometa que se ha utilizado en diversos modelos
animales, pero existe poca bibliografía sobre la utilización
de esta técnica en la sangre periférica en el pez cebra.
Actualmente el ensayo cometa ha sido aplicado con éxito
en los eritrocitos en una gran cantidad de especies de
peces, mostrando la sensibilidad de las células de la sangre
de estos animales a los efectos genotóxicos (Pandrangi et
al., 1995). También es conocido que en los estudios de
genotoxicidad in vivo se utilizan sustancias tóxicas con
efectos mutagénicos, como por ejemplo cobre, cadmio, y
arsénico, mercurio entre muchos otros (Cavas & Ergene-
Gözükara et al., 2005; Tanguay, 2018; Cassar et al., 2019;
Canedo & Rocha, 2021).
La presente investigación determinó la actividad ge-
notóxica del As en eritrocitos de la sangre periférica
utilizando como bioindicador al pez Cebra a diferentes
concentraciones y periodos de exposición. Y usándose la
técnica ensayo cometa se visualizó los efectos de la expo-
sición al As en diversas concentraciones por debajo de la
CL50, de esta manera la detección es relativamente rápida
y precisa gracias a la gran sensibilidad de dicha técnica
siendo posible visualizar los núcleos afectados a nivel del
ADN en la sangre de este pez.
MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se desarrolló entre enero y
noviembre del año 2019. Los peces fueron seleccionados
del stock de D. rerio pertenecientes al Laboratorio de
Mejora Genética y Reproducción Animal de la Facultad
de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad
Nacional Federico Villarreal en la ciudad de Lima, Perú.
Material biológico
Para el estudio se utilizaron un total de 50 especímen-
es de peces adultos de ambos sexos de diversos acuarios
de Lima Metropolitana y se aclimataron en condiciones
controladas del Laboratorio de Mejora Genética y Repro-
ducción Animal de la Facultad de Ciencias Naturales y
Matemática de la Universidad Nacional Federico Villar-
real, Lima, Perú.
Obtención de concentración letal media (CL50)
Se observó la supervivencia de un grupo de seis peces
en tres repeticiones y las de un grupo control del mismo
número durante 96 h usando las siguientes concentracio-
nes como se muestra en la figura 1 (Barch et al., 1997;
Ramírez & Mendoza, 2008; Scotto et al., 2019; Nava-Ri-
vera et al., 2021). Las soluciones de prueba en recipientes
de vidrio fueron añadidas y se registró la mortalidad a
las 96 h y finalmente se ingresaron los datos al programa
Genotoxic activity of arsenic
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estadístico Probit (STATGRAPHICS Centurion XVIII,
2016) para obtener la estimación de la CL50. Luego de
la obtención de la CL50 con los límites de confianza al
95% se usaron concentraciones por debajo de la CL50
fraccionadas al 1/2, 1/5, 1/10 con tres repeticiones más
su control como en la fig. 1 (Barch et al., 1997; Ramírez
& Mendoza, 2008; Scotto et al., 2019; Nava-Rivera et
al., 2021).
Figura 1. Esquema para determinar la CL50. A. Ensayo preliminar para determinar el posible CL50 del arsénico en el
pez cebra (Danio rerio) hasta las 96 h de exposición. B. Ensayo mostrando las repeticiones por cada concentración para
determinar el CL50 del arsénico realizado a las 24, 48, 72 y 96 h de exposición (Scotto et al., 2019).
Obtención de cometas
Con la finalidad de obtener los cometas se siguió un
protocolo ya estandarizado para el uso del ensayo cometa.
En un portaobjetos se formó una capa delgada de agarosa
de normal punto de fusión al 1,5% (Christofoletti et
al., 2009). En un “beaker” se vertió la agarosa líquida y
se sumergió el portaobjetos unas 25 a 30 veces dejando
un espacio de 30 seg en cada una y se deja secar a
temperatura ambiente por 1 ½ - 2 h y luego se aplica
sobre la primera capa la mezcla de 5 µL de sangre
periférica de D. rerio. con 85 µL de agarosa de bajo punto
de fusión al 0,5% (Christofoletti et al., 2009). Luego
se colocó un cubreobjetos sobre ella y llevar a 4 °C por
10 min. Pasado los 10 min se retiró del portaobjetos la
laminilla cubreobjetos y se agregó 85 µL de agarosa de
bajo punto de fusión 0,5% (Christofoletti et al., 2009),
se colocó una laminilla cubreobjetos y se llevó a 4 °C
por 10 min. Luego las láminas fueron cubiertas en una
solución de lisis constituida por 2,5M NaCl, 100mM
EDTA, 10mM Tris pH10, 20 ml DMSO y 1 ml Tritón
X-100 por 1h y media a 4°C en oscuridad. Al finalizar,
las láminas son extraídas y lavadas con una solución de
electroforesis; Dejándose secar. Después se colocaron las
láminas en una placa Petri con solución de denaturación
(NaOH 300mM y EDTA 1mM, pH 12) durante 20 min
en oscuridad y a 4°C, al término del tiempo las láminas
son puestas en la cámara electroforética oscura con
solución de electroforesis por 20 min, 21 V. y 270 mA.
Estas son lavadas con 3 ml de solución de neutralización:
0,4M Tris-HCl, pH 7,5 durante cinco min; dejándose
secar las láminas por 20 min. Se sumergen las láminas
en etanol absoluto por 10 min para fijar y al terminar el
tiempo se dejan secar por 20 min. La solución de 0,25
% de Nitrato de plata, 40 µL/100 mL de formaldehído
37% y agua destilada, penetra en la célula y tiñe el núcleo.
Las láminas fueron cubiertas con la solución de nitrato
de plata por 15 min hasta observar oscurecimiento de la
lámina. Luego fueron enjuagadas con agua destilada y se
dejaron secar por 20 min. Al observar en el microscopio
las células tienen apariencia de cometas con una cabeza en
la región nuclear y una cola que contiene los fragmentos o
roturas que migran en dirección del ánodo en las láminas.
Finalmente, estas fueron ser observadas a un aumento de
400x para su conteo y fotografiado.
Consideraciones éticas
Los experimentos se realizaron de acuerdo con todos los
protocolos de bioseguridad en el laboratorio de Genética y