ORIGINAL ARTICLE/ ARTÍCULO ORIGINAL
Biotempo (Lima)
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ISSN Versión Impresa: 1992-2159; ISSN Versión electrónica: 2519-5697
Biotempo, 2017, 14(1), jan-jun: 35-39.
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BACTERIA OF THE GENUS
VIBRIO ON SAMPLES OF AULACOMYA ATRA “CHORO” FROM THE
FISHING TERMINAL OF VILLA MARIA DEL TRIUNFO, LIMA, PERU
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL GENERO
VIBRIO EN MUESTRAS DE AULACOMYA ATRA “CHORO”
PROCEDENTES DEL TERMINAL PESQUERO DE VILLA MARÍA DEL
TRIUNFO, LIMA, PERÚ
Bryan Canal1; Sergio Cruz1; Valeria Valle-Riestra1; Juan Carlos Ramos2 & Tomas Agurto2
1 Universidad Ricardo Palma, Facultad de Ciencias Biológicas. 2 Instituto de Control y Certicación de la Calidad e Inocuidad Alimentaria
de la Universidad Ricardo Palma – ICCCIA-URP.
carlos.ramosg@urp.pe / icccia.urp@urp.edu.pe
ABSTRACT
Bivalve molluscs are considered organisms of great economic and social importance. However, they have been identied as
agents of food poisoning. Therefore, the objective of this work was to evaluate the isolation and identication of bacteria of
the genus Vibrio in samples of Aulacomya atra “choro” from the shing terminal of Villa María del Triunfo, Lima, Peru, which
link them with outbreaks of enteric conditions. A total of 30 samples of the bivalve mollusc A. atra was analyzed. Interest was
focused on species of the genus Vibrio, using the methodology recommended by the Food and Drug Administration (FDA)
and Bacteriological Analytical Manual (BAM) for the isolation of Vibrio in samples of marine origin. Of the 30 analyzed
samples, a total of 8 Vibrio strains was isolated, predominantly Vibrio alginolyticus. No Vibrio cholerae was present. Seven strains
corresponded to Vibrio alginolyticus and 1 strain to Vibrio parahaemolyticus, responsible for gastroenteritis due to the consumption
of raw or undercooked seafood.
Keywords: Molluscs – Vibrio cholera – Foodborne diseases
RESUMEN
Los moluscos bivalvos son considerados organismos de gran importancia económica y social. Sin embargo, han sido identi-
cados como agentes de toxiinfecciones alimentarias. En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue evaluar aislar e identi-
car bacterias del genero Vibrio en muestras de Aulacomya atra “choro” procedentes del terminal pesquero de Villa María del
Triunfo, Lima, Perú, que los vinculan con brotes de afecciones entéricas. Se analizaron un total de 30 muestras del molusco
bivalvo A. atra. Se centró el interés por especies del género Vibrio, utilizándose la metodología recomendada por la “Food and
Drug Administration” (FDA) y “Bacteriological Analytical Manual” (BAM) para el aislamiento de Vibrio en muestras de origen
marino. De las 30 muestras analizadas se aislaron un total de 8 cepas de Vibrio, con predominancia Vibrio alginolyticus. No hubo
presencia de Vibrio cholerae. Siete cepas correspondieron a Vibrio alginolyticus y 1 cepa a Vibrio parahaemolyticus, responsable de la
gastroenteritis por el consumo de mariscos crudos o poco cocidos.
Palabras claves: Moluscos – Vibrio cholerae – Toxiinfecciones alimentarias
ORIGINAL ARTICLE/ ARTÍCULO ORIGINAL
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INTRODUCCIÓN
El género Vibrio, es una bacteria Gram negativas cuyo
hábitat son los ambientes marinos y estuarinos. Sin
embargo, algunas especies de Vibrio son patógenos en
humanos, siendo Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnicus
y Vibrio cholerae los más importantes. En este sentido,
V. parahaemolyticus es reconocido en todo el mundo
como el agente causal de la gastroenteritis humana
resultante del consumo de mariscos crudos o poco
cocidos. V. vulnicus ha sido frecuentemente asociado
a infecciones graves causadas por la exposición de
las heridas al agua de mar. Finalmente, V. cholerae es
el agente causal del cólera y es de relevancia especial,
ya que se ha detectado en aguas salobres en todo el
mundo (Tall et al., 2012; Cantet et al., 2013); Mannas
et al., 2014.
En los Estados Unidos, V. vulnicus es responsable del 95
por ciento de todas las muertes después de la ingestión
de mariscos crudos o poco cocidos. Diferentes factores
han sido implicados en la virulencia de V. vulnicus,
Incluyendo el gen vvhA que codica la Citolisina
hemolítica (Oliver, 2006). Vibrio cholerae, el agente causal
de cólera, se ha detectado en aguas naturales y salobres
en todo el mundo. Esta especie también ha sido aislada
de áreas donde no se han reportado casos clínicos de
cólera (Colwell et al., 1977). Sin embargo, la mayoría de
los aislamientos medioambientales son de V. cholerae no
O1/no O139 capaz de causar brotes de diarrea a nivel
local (Rippey, 1994).
La ocurrencia de brotes de infección debido a cepas de
vibrios ambientales no se ha considerado de relevancia
clínica, pero se ha correlacionado con los factores de
virulencia (González-Escalona et al., 2006). Debido
a estos problemas, un monitoreo rápido y conable
de las cepas patógenas de Vibrio y sus factores de
virulencia en los productos marinos o hidrobiológicos
son de gran interés para la salud humana y la economía.
Los métodos de cultivo estándar de laboratorio
utilizados para identicar los Vibrios patógenos
tienen estas características: consumen mucho tiempo,
requieren mucha mano de obra, no atacan los factores
de virulencia asociados con enfermedades humanas y
no pueden detectar los microorganismos en el estado
viable, pero no cultivable (Vora et al., 2005).
La necesidad de vigilar adecuadamente las amenazas
biológicas en salud ha impulsado el desarrollo de
tecnologías avanzadas investigación para la detección
de patógenos. Los métodos moleculares son adecuados
i) para una detección independiente del cultivo del
microorganismos, ii) identicar con precisión las
especies bacterianas, y iii) proporcionar datos sobre el
potencial patogénico de los microorganismos (Wilson
et al., 2002).
En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue aislar
e identicar bacterias del género Vibrio en muestras de
Aulacomya atra (Molina, 1782) “choro” procedentes del
terminal pesquero de Villa María del Triunfo, Lima,
Perú.
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención y procesamiento de la muestra
Fueron colectadas 30 muestras del molusco bivalvo (A.
atra) “choro” procedentes del Terminal Pesquero de
Villa María del Triunfo (12°10’24.2”S 76°56’52.0”W),
ubicado entre las Avenidas Pachacutec y María Parado
de Bellido en el distrito de Villa María del Triunfo de la
Ciudad de Lima, Perú. Se colocaron en bolsas plásticas
de cierres herméticos y se transportaron en un cooler
con hielo (4°C) al Laboratorio de Microbiología de
la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Ricardo Palma, Lima, Perú. Los individuos fueron
desvalvados y homogenizados individualmente en una
licuadora con solución salina fosfatada suplementada
con 2% de NaCl durante 4 seg. Luego, se tomó 1
mL del homogenizado y se inoculó en 9 mL de agua
peptonada alcalina (APA) más 2% de cloruro de sodio
(NaCl). Los tubos se incubaron a 35-37°C durante 18
h (FDA/BAM, 1998).
Aislamiento e identicación
Los tubos con crecimiento positivo, fueron sembrados
en agar TCBS. Las placas fueron incubadas a 35 -37°C
por 24 h. Las colonias que presentaron características
típicas de Vibrio, fueron seleccionadas para formar
parte del cepario, además fueron sembradas en el
medio HiCrome Vibrio Agar.
Preparación del cepario y pruebas bioquímicas
Las colonias seleccionadas fueron sembradas en tubos
con agar nutritivo suplementado con NaCl al: 0%, 1%,
6% y 9% para la obtención del cepario. Posteriormente,
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Isolation and identication of Vibrio on Aulacomya
se realizó la coloración diferencial de Gram, siembras
en medio HiCrome Vibrio Agar y análisis de ensayo
bioquímicos en LIA, SIM, Citrato y TSI, así como
pruebas de oxidasa y catalasa (FDA/BAM, 1998).
Serología y análisis moleculares
Se realizaron las pruebas serológicas para los serotipos
de V. cholerae: O139, Inaba y Ogawa (FDA/BAM,
1998). Además, se realizaron las pruebas con PCR
convencional para los genes de virulencia ompW y ctx
(Menezes et al., 2014). En colaboración con la Naval
Medical Research Unit Six (NAMRU-6), se realizaron
las pruebas de tipo Phoenix 100 y PCR convencional.
RESULTADOS
En la Figura 1 se observa en la parte superior la siembra
en agar selectivo y diferencial TCBS, observándose
colonias amarillas (Vibrio alginolyticus) y colonias
verdes (Vibrio parahaemolitycus), y en la parte inferior se
observan las pruebas en medio HiCrome Vibrio Agar.
En la Figura 2 se observa la coloración diferencial de
Gram realizada a los cepario observándose a los bacilos
curvos Gram negativos, conrmándose la presencia
del género Vibrio. Los resultados fueron negativos
para los ensayos serológicos con el reactivo para
O139, Inaba y Ogawa. Se conrma mediante el ensayo
de pruebas moleculares que no existe la presencia de
Vibrio cholerae para las muestras procesadas (Fig. 3).
Pero mediante el equipo automatizado Phoenix 100 se
conrmó la presencia de siete cepas de V. alginolyticus y
una cepa de V. parahaemolitycus.
Figura 1. Superior: colonias aisladas en agar TCBS. Inferior: colonias
aisladas en HiCrome agar.
Figura 2. Vibrio: Bacilos curvos Gram negativos.
Figura 3. Resultado del perl electroforético de tres
cepas identicadas genotípicamente como Vibrio
cholerae utilizando cebadores para el gen especíco de
la especie OmpW y CTX en PCR.
DISCUSIÓN
El principal objetivo de este estudio fue el aislamiento
e identicación de bacterias del género Vibrio en
muestras de A. atra “choro” procedentes del Terminal
Pesquero de Villa María del Triunfo, Lima, Perú. En
comparación con otros estudios que investigaron
mejillones (Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis)
(Romero et al., 2014), el porcentaje de muestras de
Vibrio positivas en el presente estudio fue menor que el
encontrado en estudios previos realizados en Alemania
(74,4% en el mar de Wadden), Jónico (Mar Piccolo del
Mar de Tarento: 60%) e Italia (Mar Adriático: 48,4%)
(Ripabelli et al., 1999; Cavallo & Stabili, 2002; Lha &
Kuhne, 2007). La diferencia obtenida entre nuestros
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resultados y estos informes puede estar asociada con
la existencia de diferentes condiciones climáticas en las
diferentes áreas geográcas.
El uso de dos medios de agar (TCBS y el medio
HiCrome Vibrio Agar) en el presente estudio para
aislar Vibrio spp., puede inuir en la detección del
número de muestras positivas con respecto a estudios
previos (por ejemplo, Ripabelli et al. (1999) y Lha &
Kuhne (2007)) que utilizaron solo medio con TCBS. El
medio HiCrome Vibrio Agar contiene sustratos para
la beta-galactosidasa. Se desarrolló especícamente
para diferenciar V. parahaemolyticus, V. vulnicus, V.
cholerae non O1 non O139 y otros Vibrio directamente
en la etapa de aislamiento en base al color de la
colonia y utiliza un sustrato cromogénico (en lugar
de la fermentación del azúcar en medio de cultivo
tradicional tal como TCBS). En el medio HiCrome
Vibrio Agar, las colonias de V. parahaemolyticus fueron
verde azuladas. Las de V. vulnicus y V. cholerae parecían
purpuras, mientras que las colonias de V. alginolyticus
eran incoloras. Nuestros resultados sugieren que el
medio HiCrome Vibrio Agar fue más eciente y preciso
para la identicación de Vibrio en mejillones que el
agar TCBS convencional. Este resultado coincidió con
Blanco-Abad et al. (2009) y Di Pinto et al. (2011). Vibrio
alginolyticus y V. parahaemolyticus fueron las especies
encontradas en A. atra. Vibrio alginolyticus fue la especie
más abundante recuperada de las muestras. De hecho,
el agua de mar es el hábitat normal de V. alginolyticus y
se aísla del agua de mar y de mariscos en muchas partes
del mundo.
De las 30 muestras analizadas, 8 (27%) presentaron la
presencia del género Vibrio, que se evaluaron en los
ensayos microbiológicos y bioquímicos realizados.
Así mismo, de estas 8 cepas aisladas, ninguna fue
identicada como V. cholerae mediante las pruebas
moleculares empleadas. Se concluyó mediante el equipo
automatizado Phoenix 100 que siete cepas (87,5%)
correspondieron a V. alginolyticus y una cepa (12,5%)
a V. parahaemolyticus. En conclusión, los resultados
observados en el presente estudio mostraron que Vibrio
alginolyticus fué el más abundante entre los Vibrio spp.
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