Biotempo 2006, Volumen 6,
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INFLUENCIA DEL ÁCIDO ASCÓRBICO EN LA MADURACIÓN in vitro
DE OVOCITOS DE PORCINO
Hugo Mauricio Gonzáles Molfino1
RESUMEN
El presente tiene como objetivo esclarecer la influencia del ácido ascórbico durante la
maduración de ovocitos de porcino in vitro. 845 complejos ovocito-cúmulo (COCs)
seleccionados de ovarios de porcino, pre-púberes se incubaron en el medio de maduración
(NSCU-23) que contenía ácido ascórbico en diferentes dosis: 0 (control), 250 y 500 µM
respectivamente. En todos los tratamientos se visualizó la expansión de las células del cúmulo
al término del cultivo (44 horas). Se encontraron ovocitos maduros con corpúsculo polar en
las diferentes concentraciones de ácido ascórbico, 71.8% en el control, 65.7% en el de 250
µM y 59.5% en el de 500 µM .
Estos resultados indicarían que el rol antioxidante del ácido ascórbico estaría encubierto por
la presencia de antioxidantes como las superoxidismutasas y el glutation entre otros presentes
en el fluido folicular de porcino.
Palabras Claves: Maduración de ovocitos, porcinos, acido ascórbico.
SUMARY
The objective of this study was to elucidate the role of ascorbic acid during in vitro porcine
oocyte maturation. 845 Cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 44 h in NCSU
23 supplemented with cysteine, gonadotropins, 10% porcine follicular fluid, and ascorbic acid
In all treatments, cumulus expansion was observed in cultures of 44 hours.
Were mature oocytes with polar corpuscle in the different ascorbic acid concentrations,
71,8% in the control, 65,7% in the of 250 µM and 59,5% in the of 500 µM
These findings suggest that porcine follicular have a critical role in protecting oocytes against
oxidative stress-induced through the enhancement of higher levels of superoxide dismutase
and glutation content in follicular fluid.
Key words: Oocyte maturation, porcine, ascorbic acid.
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1 Laboratorio de Biología del Desarrollo. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
e-mail: hgonzalesm@mail.urp.edu.pe
INTRODUCCIÓN
Las hembras de los mamíferos tienen
ovarios bifuncionales con función exocrina
cuando liberan ovocitos y endocrina cuando
producen hormonas que regulan el
desarrollo folicular ovárico (Manikkan y et
al., 2002). El conocimiento de estos
procesos celulares es importante para
comprender y establecer métodos eficien-
tes que puedan usarse en la biotecnología
reproductiva.
En el parénquima ovárico se localizan los
complejos ovocito-cúmulo (COCs)
formados por una delicada conexión entre
las células del cúmulo y la membrana
plasmática del ovocito (Moor et al., 1980),
se pueden clasificar en relación a ciertas
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características del cúmulo (compactación,
transparencia y número de capas) así como
del citoplasma (densidad y tamaño de
gránulos). Esta conexión estructural y
funcional es necesaria para que el proceso
de maduración sea exitoso.
Los mecanismos de maduración del
ovocito ocurren tanto en el núcleo como en
el citoplasma. Las modificaciones visible en
el núcleo son la condensación de la
cromatina y la desintegración de la vesícula
germinal (GVBD) cambios que permiten el
reinicio de la meiosis hasta metafase II,
cuya expresión citológica es la presencia
del primer corpúsculo polar en la superficie
del ovocito, estado en que el ovocito es
ovulado. Por otro lado, las células del cúmulo
no sólo son importantes para que el ovocito
adquiera la competencia de desarrollo
asociada con la maduración del citoplasma
sino también que tienen un rol protector
contra el daño que pueda causar el estrés
oxidativo durante la maduración del ovocito.
Tatemoto et al., (2000) sugieren que las
células del cúmulo tienen un rol crítico en
la protección de la apoptosis inducida por
estrés oxidativo a través del incremento del
contenido de glutatión en el ovocito. El
glutatión es un tripeptido (???glutamin-
cisteinglicina; GSH) que en las células de
los mamíferos regula la síntesis, metabolismo
y secreción de los antioxidantes celulares
más importantes. Así mismo el GSH regula
algunas funciones celulares esenciales
como el mantenimiento de la integridad de
las membranas celulares la síntesis de ADN,
la modulación del plegamiento de las
proteínas, el ensamblaje de los microtúbulos
y también participa como coenzima en
diversas reacciones enzimáticas (Meister,
1989). La competencia de desarrollo se
incrementa después de fecundación in vitro
en ovocitos de porcino madurados en
presencia de acido ascórbico 2-O- á-
glucósido (AA-2G), sugiriendo que AA-2G
previene el estrés oxidativo durante la
maduración citoplasmática, permitiendo que
el ovocito de porcino alcance competencia
de desarrollo (Tatemoto et al., 2000).
Es de suma importancia que se cuente
con protocolos experimentales que admitan
el rol de los antioxidantes y de las especies
oxígeno reactivas ROS durante la
maduración y el desarrollo embrionario
temprano en mamíferos. En el presente
trabajo, usando indicadores citológicos
(presencia del corpúsculo polar y expansión
del cúmulo) se analiza la progresión de la
maduración ovocitaria de porcino en el
medio NCSU-23, al que se le adicionó ácido
ascórbico en diferentes concentraciones.
MATERIAL Y MÉTODOS
Recuperación y selección de ovocitos
Se utilizó ovarios de porcino pre-púberes,
provenientes de animales sacrificados para
el consumo humano, los cuales fueron
transportadas al laboratorio en un frasco
térmico conteniendo una solución salina
fisiológica (0.9% NaCl) a 37ºC.
Para la recuperación de los complejos
cúmulo-ovocito (COCs) se utilizó el método
de aspiración folicular (Cheong y col., 2000).
Utilizando una jeringa hipodérmica de 10
ml y una aguja de 21 G (Gauge) se aspiró
los folículos que oscilaban entre 4 – 6 mm
colocándolos en un tubo de polipropileno (50
ml) mantenido a una temperatura de 37ºC
en baño María. Luego de 10 minutos de
reposo, se extrajo el sedimento del fondo
del tubo llevándolo a las placas Petri, a las
que se le agregó 25 mM Hepes-buffer
TCM-199 suplementado con 0.1% alcohol
polivinílico y sulfato de gentamicina 50µ/
ml, sobre una platina temperada entre 30-
35ºC.
Para la selección de los COCs se tomaron
en cuenta indicadores morfológicos en el
cúmulo: número de capas, compactación,
y transparencia y en el citoplasma del
ovocito: color (densidad) y tamaño de
granúlos (Madison y col, 1992; Blondin y
Sirard, 1993; Hazeleger y col., 1995; Hosoe
y Shioya, 1997).
Maduración in vitro de los COCs
Para la maduración se utilizó el medio North
Carolina State University 23 (NCSU-23;
Petters & Wells, 1993) suplementado con
0.57 mM de cisteina, 10% fluido folicular,
10 IU/ml de gonadotropina corionica equina,
10 IU/ml de gonadotropina corionica
humana y 50 µg/ml sulfato de gentamicina
(Sigma).
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En una placa Falcon 3560 que contenía 100
ul de NCSU 23 cubierta con aceite mineral
se colocaron entre 10 a 15 COCs para
incubarlos por 20 - 24 horas a 39ºC; 5%
CO2; y 90% humedad. Transcurrido este
tiempo, los ovocitos se pusieron en el medio
NCSU 23 sin hormonas por un periodo
adicional de 22 A 24 horas.
Al término del cultivo las células del cúmulo
fueron separadas empleando un vortex por
4 minutos en una solución buffer fosfato
PBS (Dulbecco´s) sin Ca2+ y Mg2+ con
hialuronidasa al 0,1% colocándolos después
en 25 mM Hepes-buffered TCM-199. En
este medio fueron seleccionados aquellos
ovocitos maduros, que presentaron el primer
corpúsculo polar los que fueron observados
a través de una lupa estereoscópica 20x.
Los datos fueron procesados para
encontrar el nivel de significancia mediante
las pruebas de Student y Tukey.
RESULTADOS
Se seleccionaron 845 complejos ovocito-
cúmulo (COCs) que fueron obtenidos de
ovarios de porcino pre-púberes y colocados
aleatoriamente en el medio de maduración
(NSCU-23), al que se le adicionó ácido
ascórbico en diferentes dosis: 0 (control),
250 y 500 µM respectivamente. En todos
los tratamientos se visualizó la expansión
de las células del cúmulo al término del
cultivo (44 horas).
El porcentaje de ovocitos maduros que
presentaron corpúsculo polar y citoplasma
homogéneo fue de 71.8% para el control,
65.7% con 250 µM y 59.5% con 500 µM
respectivamente (ver Tabla Nº 1)
Fig 1: Expansión parcial de las células del
cúmulo en cultivo de 24 horas de
maduración (20 X)
Fig 2: Expansión total de las células del
cúmulo en cultivo de 44 horas de
maduración
(20 X)
Tratamientos No de Ovocitos (Replicaciones) % de Ovocitos Madurados
Control (NCSU-23) 255 (4) 71 ± 1.41a
NCSU-23 + 250 µM A.A 285 (4) 62 ± 2.83a
NCSU-23 + 500 µM A.A 305 (4) 59 ± 1.41b
Tabla N° 1: Efecto del acido ascórbico en el medio de maduración de ovocitos
porcino
a,b Representa diferencia significativa p <0.05
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Fig.3: Ovocito maduro con presencia del
corpúsculo polar en cultivos de 44 horas
(20 X)
DISCUSIÓN
El desarrollo embrionario está influenciado
por sucesos que ocurren durante la
maduración de los ovocitos. Si bien es cierto
que muchos ovocitos inmaduros son
capaces de completar la meiosis in vitro,
sólo un pequeño porcentaje de ellos
adquieren una correcta competencia para
continuar el desarrollo hasta el estado de
blastocisto. Los ovocitos recolectados de
ovarios procedentes de hembras
sacrificadas para el consumo humano son
una fuente extremadamente heterogénea
en términos de calidad y competencia para
el desarrollo,
El tamaño del folículo es un factor
fundamental para que el ovocito adquiera
competencia de desarrollo (Krisher, 2004),
en esta investigación se usaron folículos que
medían entre 3 a 5 mm de diámetro y
presentaban irrigación superficial, con los
que se logró una tasa de maduración
relativamente alta en todos los tratamientos.
Los COCs mantienen un acoplamiento
mecánico y funcional entre la superficie de
la membrana del ovocito con las de las
células del cúmulo que permiten un flujo
adecuado de sustancias en ambas
direcciones durante el proceso de
maduración. El flujo de sustancias se
realizan a través de modificaciones de las
proteínas de membrana denominados
conexones (Canipari, 2000). Los COCs de
24 hrs de cultivo presentan una expansión
mas compacta en relación a los cultivados
por 44 hrs donde se muestra una expansión
total de las células del cúmulo (Figs. 1y 2)
que sería consecuencia de la perdida de
acoplamiento celular durante el tiempo que
dura la maduración in vitro. La expansión
del cúmulo al término de la maduración
también ha sido observada en cultivos de
ovocitos de bovino y se explica que ocurre
por la perdida de acoplamiento intercelular
al desorganizarse los conexones, (Suzuki y
et al., 2000). Las células del cúmulo
secretarían ligandos para mantener el
diploteno meiotico (Aktas y col. 1995) hasta
que la actividad gonadotrópica induzca la
despolarización de la membrana plasmática
del ovocito, señal para el reinicio de la
meiosis hasta metafase II (Mathioli y et al.,
1990).La expresión citológica de que estos
eventos moleculares ocurren, es la
presencia del corpúsculo polar. En todos los
tratamientos los cultivos entre 44 y 48
horas de incubación presentaron ovocitos
con corpúsculos polares bien definidos
(Fig.3)
Con respecto a la influencia del ácido
ascórbico (AA) en la maduración de los
ovocitos, se ha encontrado que 71% de
COCs maduros en el medio NCSU-23 en
relación al 62% y 59% hallados en los
medios con 250 µM y 500 µM de AA
respectivamente. En el medio NCSU-37
con ácido ascórbico 2-O- á-glucósido (AA-
2G) se han encontrado 86% de ovocitos
de porcino maduros en el medio control, en
relación a 82% y 77% que aparecen
cuando se agrega al medio de cultivo 250
µM y 500µM de (AA) respectivamente
(Tatemoto et al., 2000). El fluído folicular
de porcino desempeña un papel crítico en
la protección de los ovocitos de sustancias
oxígeno reactivas mediante la activación de
isoenzimas de superoxidismutasas las que
inhiben la formación de radicales libre,
mejorando considerablemente la
maduración citoplásmica, importante, para
la competencia de desarrollo
posfecundación (Tatemoto et al., 2004).
La proporción de ovocitos maduros
encontrados (p<0.05) en los tratamientos
con y sin ácido ascórbico, se debería, de
alguna manera, a la presencia de
superoxidismutasas, y glutatión en el fluído
folicular que se adicionó al medio NCSU-
23, que estarían encubriendo la posible
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actividad antioxidante del ácido ascórbico
exógeno durante la maduración ovocitaria
de porcino.
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