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EXTRACCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE
SAPONINAS EN Agaricus bisporus
Enzio Foy Valencia1,
Débora Mac Donald,
Margot Cuyos,
Ruth Dueñas,
RESUMEN
Agaricus bisporus es un hongo, el cual es un organismo eucariótico, sin clorofila, con
un micelio conformado por hifas, que aunque no es un vegetal, se ha determinado que
presenta saponinas, las cuales son glucósidos existentes casi de forma exclusiva en las plantas.
Se ha comprobado el contenido de saponinas por medio de tres reacciones de coloración. Así
mismo se ha cuantificado un Índice Afrosimétrico de 200. Las valoraciones biológicas han
determinado que no tienen acción hemolítica in vitro ni in vivo.
Palabras claves: Agaricus, saponinas, hemólisis.
SUMMARY
Agaricus bisporus is a mushroom, which is an organism eucariotic, without chlorophyll,
with a micelio conformed by hifas that although it is not a vegetable, it has been determined
that it presents saponins, which are existent glycosides almost in an exclusive way in the
plants. It has been proven the saponins content by means of three reactions of coloration.
Likewise an Index Afrosimetric 200 has been quantified. The biological evaluations have
determined that they don’t have action hemolític in vitro neither in alive.
Key words: Agaricus, saponins, hemolisis.
1 Laboratorio de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma;
e-mail:efoy@mail.urp.edu.pe
INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos
eucarióticos, sin clorofila, heterotróficos,
acumulan glicógeno como material de
reserva, con un micelio conformado por
hifas y se nutren por absorción. Por ser
heterótrofos requieren de materia orgánica
preformada como la utilización de fuente
de carbono y energía para la síntesis de
estructuras celulares. Forman esporas
como producto de su reproducción.
El champiñón es un hongo cuyos
beneficios para la salud son prácticamente
desconocidos, sin embargo, muy conocidos
en el área culinaria como una exquisitez.
En la actualidad, se están realizando
diversos estudios en China, Alemania,
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Estados Unidos, Holanda, España y otros
países sobre sus propiedades profilácticas.
Agaricus bisporus es la especie más
cultivada en nuestro país (Fig.1). Las dos
esporas (no 4) de sus basidios contienen
núcleos entre sí, (+ y -); a diferencia de la
mayoría de las demás agaricales, en esta
especie no son necesarios los procesos
sexuales para el comienzo de un ciclo vital.
El cultivador puede propagar el hongo
exclusivamente con micelio dicariótico. Un
cultivo que tiene que producirse a una
temperatura de 18 grados, una humedad
relativa de aire del 70 al 90 %, con un
contenido de dióxido de carbono que no
supere el 0,1 %.
Los Hongos son organismos que
carecen de plastidios y de clorofila, y si por
tradición son considerados como plantas,
ocupan en realidad una posición aislada. Las
setas silvestres han sido clasificadas por los
micólogos como la clase de los
basidiomisicetes, por sus estructuras
especiales donde se forman las esporas
llamadas basidios.
Muchas setas son comestibles y
sabrosas, pero otras son peligrosas y hasta
mortales. Del género de los Agaricus
también tenemos setas peligrosas
ligeramente venenosas como el Agaricus
xanthodermus, que podría ser confundido
con el champiñón comestible, sin embargo
éste al ser trozado se torna de un brillante
color amarillo en cambio el Agaricus
bisporus se negrea.
Sin embargo, Agaricus bisporus a
pesar de estar en un reino aparte, el reino
Fungi, parece presentar algunas propiedades
propias de los vegetales como es el caso
de la presencia de saponinas, las cuales se
reportan presentes de forma casi exclusivas
en las plantas, y que es motivo de la
presente investigación.
En relación a las saponinas estas son
metabolitos secundarios, ampliamente
distribuidos en las plantas superiores, en las
que se presentan en forma de glucósidos.
Sus soluciones acuosas al ser agitadas
forman una espuma estable y abundante,
hecho este que dio origen etimológicamente,
al nombre genérico de estas sustancias
provenientes del latín sapon (jabón).
Desde el punto de vista químico, las
saponinas al ser hidrolizadas rinden de 2 a
6 residuos de monosacáridos y una porción
carbonada policíclica que es la aglicona del
glicósido, a la cual se le denomina
genéricamente sapogenina. Pueden tener
un esqueleto tipo esteroidal (de base
gonano) o de tipo triterpenoide (derivados
del escualeno), las cuales dan lugar a las 2
grandes familias de estos metabolitos: las
saponinas esteroidales y las saponinas
triterpénicas.
La solubilidad en agua de estos
compuestos está facilitada por su alto peso
molecular y la presencia de los residuos de
monosacáridos y de otros grupos polares
en la aglicona.
En ambas familias de saponinas el
enlace glucosídico se establece a través del
hidroxilo en posición 3 del anillo A de la
aglicona. Las esteroidales, se localizan en
monocotiledóneas principalmente de las
familias de las liliáceas, amarilidáceas y
dioscoreáceas y las triterpénicas en éstas
y en algunas dicotiledóneas. Las sapo-
geninas esteroidales siempre se encuentran
en la naturaleza formando parte de una
saponina, a pesar de la presencia de
saponasas, en muchas de las plantas que
sintetizan estos compuestos. Entre las
saponinas esteroidales, cabe destacar
aquéllas que tienen como aglicona a la
hecogenina y la diosgenina, compuestos
vegetales que sirven de base para la industria
de hormonas esteroidales.
Las sapogeninas triterpénicas están
ampliamente distribuidas en los reinos
vegetal y animal y se presentan en 3
estructuras químicas diferentes (30-45
carbonos): aciclícas como el escualeno,
considerado como el precursor natural de
esta familia: tetracíclicas como el
panaxadiol y pentacíclicas como la
estallogenina. Estas sustancias pueden
presentarse en sus fuentes naturales: en
forma libre: formando ésteres, o como parte
de un glicósido (saponina). Las sapogeninas
pentacíclicas se subdividen a su vez en 3
grupos: tipo lupane: tipo ursane (derivado
de la a amirina), ambos no están presentes
en los forrajes y los de tipo oleanane
(derivados de la ß amirina) presentes en
estos últimos.
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Las 2 familias de saponinas referidas
presentan un grupo de características
generales que sirven de base para su
identificación rápida: a) producción de
espuma al ser agitadas sus soluciones
acuosas, lo cual es la base de la reacción
de selivoflo empleada en el tamizaje
fitoquímico; b) producción de hemólisis de
los glóbulos rojos por la mayoría de ellas,
propiedad que se aprovecha en las técnicas
en que se cuantifica la potencia de estas
substancias; c) toxicidad en animales
poiquilotérmicos, en especial los peces
(sapotoxinas), a los cuales provocan
parálisis de las agallas (se emplean en
formas destructivas de pesca), «pescar
embarbascado»; d) producción de una
reacción positiva en la prueba de
Liebermann-Burchard. Por lo general, las
esteroidales en esta prueba manifiestan
colores que van desde el azul hasta el verde
y las triterpénicas, rosado, rojo o violeta.
Además, la mayoría de las saponinas son
solubles en diferente grado en soluciones
de etanol al 80 %, propiedad que se emplea
en diversas técnicas para su extracción y
purificación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Extracción de saponinas
La muestra de Agaricus bisporus
fue adquirida comercialmente y secada en
estufa a 60 ºC, hasta la obtención de un
peso constante. Luego se procedió a moler
la muestra.
Se pesó 5 gr. de la muestra seca y
molida y se colocó en un tubo de ensayo,
añadiéndole 6 ml de etanol al 75%; y
puesto a hervir en BM por 15 minutos. Se
filtró y el extracto etanólico se evaporó a
sequedad, con la finalidad de realizar el test
afrosimétrico y las pruebas de identi-
ficación.
Identificación de saponinas
Reacciones de Coloración.
A partir del extracto alcohólico seco
se procedió a realizar los siguientes
ensayos:
i) Prueba de Liebermann-
Burchard.- Se tomó una pequeña cantidad
de extracto y se añadió 2 ml de anhídrido
acético, 2 ml de cloroformo y se enfrió a
0ºC. Se añadió 2 gotas de ácido sulfúrico
(c). La aparición de una coloración azulada
que pasa a anaranjado para luego volverse
verde, indica que la reacción es positiva.
ii) Prueba de Salkowski.- Se tomó
una pequeña cantidad del extracto y se le
añadió 2 ml de cloroformo y 2 ml de ácido
sulfúrico. Una coloración anaranjada indica
reacción positiva.
iii) Prueba del α naftol.- En un tubo
de ensayo se colocó una pequeña cantidad
de extracto alcohólico seco y se añadió 2
ml de etanol y 2 gotas de solución 0.1% de
α - naftol adicionándose por la pared del
tubo de ensayo 2 ml de ácido sulfúrico (c).
La reacción es positiva cuando en la
interfase se forme un anillo de color violeta.
Evaluación de saponinas
Valoración de las saponinas
Las saponinas se pueden valorar por
métodos físicos como el llamado Test
Afrosimétrico y el Índice de Espuma o
Índice Afrosimétrico; o por métodos
biológicos como el Índice Hemolítico o el
Índice del Pez.
a. Test Afrosimétrico.
Se tomó la cuarta parte del extracto
etanólico seco en un tubo de ensayo y se
añadió 5 ml de agua destilada, se calentó al
BM hirviente por 2 minutos, se agitó
vigorosamente, observándose la aparición
de espuma muy persistente; la persistencia
en minutos de la espuma se califica con
cruces:
5 - 20 min. (+); 20 - 25 min. (++);
30 - Más (+++).
b. Índice afrosimétrico. (I . A.)
Es el número que expresa el
volumen en centímetros cúbicos en que
está disuelto un gramo de material
saponínico para producir espuma de un
centímetro de altura en un tubo de 16 mm.,
de diámetro que contiene 10 ml., de
solución.
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Este método de evaluación de
saponinas está basado en la propiedad
físico-química que presentan las soluciones
acuosas de saponinas, de disminuir la
tensión superficial de los líquidos acuosos,
provocando abundante espuma por agi-
tación.En esta medida es preciso efectuarla
en determinadas condiciones para que
pueda tomarse como base analítica. Para
determinarlo se procedió primero a
preparar un lixiviado de la muestra al 0.5%.
Se tomaron 10 tubos del mismo
diámetro (16 mm) y se colocó 1 ml. de la
solución de la muestra en el primer tubo, 2
ml., en el segundo tubo, 3 ml., en el tercer
tubo y así sucesivamente hasta llegar a 10
ml., en el décimo tubo.
Se completó a 10 ml., con agua
destilada en todos los tubos, se agitó medio
minuto y se dejó en reposo a los tubos por
15 minutos al cabo de los cuales se vio en
qué tubo la espuma alcanza 1 cm., de altura
(medida convencional).
Si este índice es inferior a 20 puede
decirse que la muestra prácticamente no
contiene saponinas.
c. Índice hemolítico
Es el número que expresa en ml el
volumen en que está disuelto un gramo de
droga para producir hemólisis a su máxima
dilución.
Para esta determinación se preparó
una suspensión de glóbulo rojos, lavados
varias veces en centrífuga, con solución de
cloruro de sodio al 0,9% de manera que
contenía 2 ml de sangre en 100 ml de
solución salina.
Por otra parte se hace una lixiviación
de la muestra con solución salina al 0,9%
para obtener un soluto al 1 x 100.
Se tomaron 11 tubos en una gradilla
y se colocó en el primer tubo 0,1 ml de la
solución de saponina, en el segundo 0,2 ml,
en el tercero 0,3 ml y así sucesivamente
hasta llegar a 1 ml; en el tubo Nº 10; en el
tubo Nº 11 no se colocó solución de saponina
para que sirva de testigo.
Se agregó a todos los tubos solución
salina para completar 5 ml y 5 ml de
suspensión de glóbulos rojos, se mezcló por
inversion unas cinco veces cada tubo.
A las 15 horas se observa a partir
de qué tubo comienza a producirse
hemólisis (color rojo transparente). En los
tubos en que no se han efectuado hemólisis
los glóbulos rojos se habrán sedimentado,
quedando el líquido incoloro o ligeramente
coloreado.
d. Índice de pez
Es una constante propuesta por
Kobert y se define como la concentración
de saponina que en 100 ml de solución
determina la muerte de un pez de una
especie determinada y un peso dado
después de una hora de inmersión en la
solución.
Los peces que se emplean para este
índice son generalmente Leuciscus rutilis
o Carassius vulgaris, de dos a cuatro cm
de longitud aproximadamente.
Se operó con lotes de cinco peces
Poecilia reticulata «gupis»colocados en
dosis distintas del extracto acuoso: 0.5%;
1%, 3%, 4% y 5%.
Generalmente cuando se usa una
infusión de la muestra al 1% deben morir
en el tiempo señalado (1 hora) por lo menos
3 de los 5 peces. Los peces mueren por la
acción hemolítica que producen las
saponinas en las cavidades braquiales de
estos animales.
RESULTADOS
Identificación de saponinas
Reacciones de Coloración.
i. Prueba de Liebermann-Burchard.
Se verificó la aparición de una
coloración azulada que pasa a anaranjado
para luego volverse verde, lo cual nos indicó
que la reacción es positiva.
ii. Prueba de Salkowski
Se comprobó la aparición de una
coloración anaranjada que nos indicó
reacción positiva.
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iii. Prueba del α naftol
Se apreció que la reacción fue
positiva porque en la interfase se formó un
anillo de color violeta.
Valoración de las saponinas
a. Test Afrosimétrico
Se calificó con (+++) por haberse
mantenido la espuma por más de 30
minutos.
b. Índice afrosimétrico. (I . A.)
El tubo Nº 10 fue el que alcanzó el
mayor volumen de espuma lo cual nos
significó un I.A. = 200
c. Índice hemolítico
El resultado fue negativo
d. Índice de pez
También fue negativo en el sentido
que ninguno de los peces se murió. Sin
embargo se pudo apreciar que en las
soluciones acuosas al 4% y 5% de nuestra
muestra de Agaricus, los peces
presentaban aspecto hemorrágico (aspecto
enrojecido) en la zona branquial y en la
zona bucal. (Fig.2)
DISCUSIÓN
Teniendo en consideración que
Agaricus bisporus pertenece al reino
Fungi, es decir es un hongo basidiomiceto,
el cual es de uso frecuente en la
alimentación humana; hemos logrado el
hallazgo de saponinas en la especie referida;
sin embargo por los reportes que se tienen
en la literatura especializada, estos
glucósidos, responsables de producir
espuma por agitación en soluciones acuosas,
se reportan presentes únicamente en los
vegetales, es decir en el Reino Plantae; y
excepcionalmente en el reino animal se
reporta en los pepinos de mar; pero no en
otros grupos taxonómicos o reinos
diferentes a los indicados. Sobre la
presencia de saponinas en hongos no se
tiene información alguna. Es así que para
determinar la existencia de estos glucósidos
en Agaricus bisporus hemos recurrido a
diversos procedimientos que nos permitan
aseverar que efectivamente la especie
posee saponinas.
El primer procedimiento realizado
consistió en extraer las saponinas de las
muestras secas y molidas mediante una
extracción alcohólica que nos sirvió para
realizar las identificaciones por medio de
reacciones de coloración. Utilizamos tres
reacciones; en donde, la reacción de una
sola de ellas nos indicaría la presencia de
saponinas; en las tres pruebas realizadas
para tal efecto (Liebermann-Burchard
Salkowski y á naftol), la reacción fue
positiva, lo cual nos permite afirmar que las
saponinas están presentes en nuestro
material de estudio. Así mismo, el test
afrosimétrico nos hizo comprobar la
persistencia de la espuma por más de 30
minutos (+++), que también nos indica la
existencia de las saponinas. Por lo tanto, lo
que nos correspondía realizar es la
valoración de las saponinas. Se efectuó el
Índice Afrosimétrico, que es la valoración
físico-química de la capacidad de producir
espuma que tienen las saponinas. Por lo
general se efectúa con un lixiviado de la
muestra al 1%, cuando hay moderadas
concentraciones de saponinas; con
Agaricus lo hicimos en una proporción de
0.5% lo cual nos hizo cuantificar un Índice
Afrosimétrico de 200; considerando que
valores por debajo de IA. = 20 se estima
que prácticamente no presenta saponinas;
nuestra muestra, por lo tanto, presenta
abundante proporción de saponinas.
También realizamos pruebas de
valoración biológica, como es el Índice
Hemolítico y el Índice de Pez, con la
finalidad de comprobar si presenta alguna
acción tóxica o negativa con respecto a la
capacidad hemolítica que se le atribuye a
las saponinas. Dichas pruebas fueron
negativas. La primera se efectuó con
eritrocitos de carnero in vitro y la segunda
con pececillos in vivo. Debemos indicar
que en la evaluación con los peces se debe
de verificar la muerte de tres de los cinco
peces que se han sumergido en soluciones
de diversa concentración de nuestra
materia de estudio. A pesar que no murió
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ninguno de los peces, en las soluciones
acuosas al 4% y 5% de nuestra muestra
de Agaricus, los peces presentaban aspecto
hemorrágico (aspecto enrojecido) en la zona
branquial y en la zona de la boca. Lo cual a
su vez también nos sirve para verificar la
presencia de saponinas, puesto que se
presentó una cierta acción hemorrágica.
CONCLUSIONES
1. Se comprobó la presencia de
saponinas en Agaricus bisporus por medio
de tres reacciones de coloración.
2. Las saponinas presentes en A.
bisporus tienen un Índice Afrosimétrico de
200. 3. Las saponinas presentes en A.
bisporus no presentan una acción tóxica
sobre los eritrocitos, es decir no tienen
acción hemolítica tanto in vitro como in
vivo.
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Figura 1. Hongo Agaricus bisporus Figura 2. Índice de pez
