PAIDEIA XXI
Vol. 8, Nº 2, Lima, julio-diciembre 2018, pp. 327-374
ISSN Versión Impresa: 2221-7770; ISSN Versión Electrónica: 2519-5700
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
VALIDATION OF THE ANALYTICAL TECHNIQUE
FOR THE TEST OF BACTERIAL ENDOTOXINS (GEL–
CLOT) IN CENTRAL VENOUS CATHETER OF 30 CM
VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA PARA LA
PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (GEL–
CLOT) EN CATETER VENOSO CENTRAL DE 30 CM
Jorge Luis Ullilen1 & José Iannacone2
1 Laboratorio de Ecología y Biodiversidad Animal (LEBA). Facultad de Ciencias Naturales y
Matemática, Universidad Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú
2 Laboratorio de Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
Lima, Perú
Author for correspondence: E-mail: jose.iannacone@urp.edu.pe
Within the quality control of pharmaceutical products, the quantication
of bacterial endotoxins is established by the Limulus amebocyte lysate (LAL)
method by means of a coagulation reaction and gel formation (gel-clot). The
test was validated in the central venous catheter product of 30 cm, with which
we worked with qualied equipment, validated depyrogenation process, current
reagents and apyrogen material. The sensitivity of the LAL reagent (0.03 EU · mL-
1) was checked and the maximum valid dilution (MVD) of 1/8 was calculated.
The tests showed that the product does not inhibit or potentiate the reaction of
the reagent. The conditions for the validation of LAL by the gel-clot method in
this product were standardized. The method is extended for the determination
of bacterial endotoxins in other medical devices by intravenous route and to
demonstrate that its use is valid for compliance with the regulations.
Keywords: Central venous catheter – quality control – bacterial endotoxins
– maximum valid dilution
ABSTRACT
doi:10.31381/paideia.v8i2.2050
Ullilen & Iannacone
328
PAIDEIA XXI
INTRODUCCIÓN
Actualmente, la calidad, inocuidad
y seguridad de los productos farma-
céuticos son de importancia, debido a
su amplio uso en la prevención y tra-
tamiento de muchas enfermedades.
Para el cumplimiento de las Buenas
Prácticas de Laboratorio (BPL), las
Buenas Prácticas de Manufactura en
el control de calidad, una de las exi-
gencias es la validación de las técnicas
analíticas, para lo cual se requiere de
la calicación de los equipos que inter-
vienen en la prueba, la validación del
desempeño de los equipos y la valida-
ción de la prueba propiamente dicha,
con el n de garantizar la conabilidad
de los resultados. La calicación de los
equipos se divide normalmente en tres
segmentos: calicación de instalación,
calicación operativa y calicación de
desempeño (OMS, 1998). La calica-
ción de los equipos tiene como objetivo
asegurar que el equipo sea el adecuado
para la labor que realiza, que su ins-
talación y su operación se encuentren
de acuerdo a los requisitos entregados
por el fabricante y por último, que el
desempeño del equipo sea óptimo, es
decir, los parámetros de funcionamien-
to permanezcan estables y con las mis-
mas características durante el proceso
(Novitsky, 1991, 1994; Fariña, 2006;
Cervantes et al., 2009).
En relación con cada prueba de
operación y desempeño, la prueba se
efectúa tres veces consecutivas a efecto
de demostrar que los equipos cumplan
uniformemente los criterios de acepta-
ción (Groven, 1990; IAEA, 1992; OMS,
1998; García, 2009; IHC, 2010).
Para asegurar que los materiales
que se utilizan en el proceso no inter-
eran en los resultados, se realiza la
validación del proceso de despirogeni-
zación, el cual se dene como la elimi-
Dentro del control de calidad de los productos farmacéuticos, se establece la
cuanticación de endotoxinas bacterianas por el método del lisado de amebocitos
de Limulus (LAL), mediante una reacción de coagulación y formación de un gel
(gel-clot). Se validó la prueba en el producto catéter venoso central de 30 cm,
para lo cual se trabajó con equipos calicados, proceso de despirogenización
validado, reactivos vigentes y material apirógeno. Se comprobó la sensibilidad
del reactivo de LAL (0,03 UE·mL-1) y se calculó la máxima dilución válida (MVD)
de 1/8. Las pruebas demostraron que el producto no inhibe ni potencia la
reacción del reactivo. Se estandarizaron las condiciones para la validación de
LAL por el método gel-clot en este producto. El método se hace extensivo para
la determinación de endotoxinas bacterianas en otros dispositivos médicos por
vía endovenosa y demostrar que es válido su uso para el cumplimiento de la
normativa.
Palabras clave: catéter venoso central – control de calidad – endotoxinas
bacterianas – máxima dilución válida
RESUMEN
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
329
PAIDEIA XXI
nación de todas las sustancias pirogé-
nicas, incluyendo las endotoxinas bac-
terianas. El método más común para
eliminar pirógenos es el mecanismo de
despirogenización por calor seco (Pé-
rez, 1996; WHO, 2011; EP, 2012; EI,
2016). El método clásico y más efectivo
para la despirogenización de materia-
les termorresistentes es mediante la
aplicación de calor seco en hornos. En
la validación, se determina con bioin-
dicadores de endotoxinas y se cuanti-
ca con el empleo del ensayo del lisa-
do de amebocitos de Limulus (LAL) por
el método gel-clot (Joiner et al., 2002;
Perdomo & Montero, 2003; Osorio et
al., 2007; Akbar et al., 2010; Sharma
et al., 2011; Mitra et al., 2014).
En la industria farmacéutica, los
ambientes de los laboratorios, el per-
sonal, los implementos y equipos de
trabajo, así como el agua y materias
primas, albergan microorganismos
que se desarrollan y afectan la cali-
dad de los productos (Zimmer & Spies,
1979). Un contaminante propio de ori-
gen bacteriano son las denominadas
endotoxinas provenientes de las bac-
terias gram-negativas (Joiner et al.,
2002; Carrillo et al., 2006; FA, 2012).
La manufactura de dispositivos médi-
cos involucra una serie de operaciones
y controles orientados a obtener pro-
ductos que cumplan las especicacio-
nes sicoquímicas y microbiológicas,
dando énfasis en asegurar su este-
rilidad y evitar la presencia de agen-
tes contaminantes (microorganismos,
partículas y pirógenos). Las pruebas
microbiológicas que se realizan para
los dispositivos médicos estériles como
productos nales, son dos: la esterili-
dad que garantiza la ausencia de mi-
croorganismos, y las endotoxinas bac-
terianas que cumplen con el límite de
endotoxinas (Joiner et al., 2002; USP,
2012abc; Dobrovolskaia et al., 2014;
Wheeler, 2017).
El uso de dispositivos médicos es-
tériles contaminados con endotoxinas,
pueden inducir muchas respuestas
biológicas, así la reacción pirógena
puede manifestarse en liberación de
histamina y alteración de la permeabi-
lidad vascular. Estas respuestas pue-
den poner o no en peligro la vida del
individuo, dependiendo del estado del
paciente y de la cantidad de endoto-
xina inyectada. Las endotoxinas son
muy potentes, una dosis de solamente
1 a 10 ng·Kg-1 de endotoxina purica-
da es capaz de provocar en el hombre
una respuesta febril (Pérez, 1996; Joi-
ner et al., 2002).
Es por ello que la industria farma-
céutica requiere estandarizar técnicas
rápidas y conables, que permitan
detectar la presencia de endotoxinas
bacterianas, como lo es la prueba de
LAL. Esta prueba se basa en la agluti-
nación de extractos de amebocitos de
sangre de Limulus (O.F. Müller, 1785)
producido por cantidades del orden
de pg de lipopolisacáridos y puede de-
tectar 300 células de Escherichia coli
(Migula 1895) (Aldaña, 1997; Caro &
Cruz, 2006; Burguet & Brito, 2012;
Mitra et al., 2014). El método detecta
células viables y no viables (Carrillo
et al., 2006). En tanto una alternativa
para detectar pirógenos, es el ensayo
de pirógenos en conejos, capaz de de-
Ullilen & Iannacone
330
PAIDEIA XXI
tectar cualquier sustancia pirogénica,
el ensayo de LAL solo detecta endoto-
xinas (Joiner et al., 2002; Solís, 2004;
Wheeler, 2017).
Se ha comprobado la equivalencia
entre el ensayo LAL y la prueba de pi-
rógenos (Sandle, 2012). El ensayo LAL
resultó ser al menos 10 veces más sen-
sible y es considerado un método de
cuanticación. Es la prueba más sen-
sible existente para detectar endotoxi-
nas producidas por bacterias Gram-
negativas y el procedimiento es simple,
especíco, rápido, sensible y económi-
co, comparándolo con la prueba de pi-
rógenos en conejos de la USP (Pérez,
1996; Burguet et al., 2012; Dobrovols-
kaia et al., 2014; Wheeler, 2017).
Si bien las endotoxinas no son los
únicos agentes pirógenos, las endotoxi-
nas son los pirógenos que preocupan a
la industria farmacéutica debido a que
se han encontrado entre los lotes con-
taminados y debido a su alta resisten-
cia a la destrucción térmica y química,
sobreviven a los métodos ordinarios
de esterilización (Carrillo et al., 2006;
Wheeler, 2017). Las otras fuentes de
pirogenicidad (contaminación química
o por partículas) pueden ser controla-
das siguiendo métodos de fabricación
cuidadosos, pero las endotoxinas son
difíciles de eliminar porque resisten
la degradación por esterilización con
vapor y no se eliminan tampoco por
los medios normales de ltración. Las
endotoxinas son compuestos químicos
complejos que se encuentran exclusi-
vamente en la membrana externa de la
pared celular de las bacterias Gram-
negativas (Pérez, 1996), las cuales cre-
cen en las soluciones con un mínimo
de nutrientes, tales como el agua al-
macenada después de la destilación o
desionización (Ouédraogo et al., 2009).
Generalmente es antieconómico y en
ocasiones prácticamente imposible,
eliminar la contaminación pirógena
una vez que está presente (Carrillo et
al., 2006).
La endotoxina es el lipopolisacári-
do (LPS) de alto peso molecular com-
ponente de la pared celular externa de
las bacterias gram-negativas que cau-
sa ebre, meningitis, y una caída rápi-
da de la presión sanguínea, si se intro-
ducen en la sangre o en los tejidos del
cuerpo. Los componentes de la célula
de pared exterior, se componen prin-
cipalmente de proteínas, fosfolípidos,
y LPS, que constantemente liberan en
el entorno cuando las bacterias Gram-
negativas se dividen o lisan (Neugodo-
va et al., 2003; Wheeler, 2017).
El objetivo del presente trabajo fue
realizar la validación de la técnica ana-
lítica para la prueba de endotoxinas
bacterianas-método gel-clot en un ca-
téter venoso central de 30 cm.
MATERIALES Y MÉTODOS
AMBITO DE ESTUDIO
El desarrollo de la validación de la
técnica analítica para la prueba de en-
dotoxinas bacterianas-método gel-clot
en el catéter venoso central de 30 cm,
se realizó en las instalaciones de la
empresa Dentilab del Perú, en la sec-
ción de microbiología, en el área de re-
cuento microbiano.
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
331
PAIDEIA XXI
EQUIPOS E INSTRUMENTOS PARA LA CALIFICACIÓN DE EQUIPOS
La Tabla 1 indica los equipos e instrumentos empleados para la calicación de
equipos.
EQUIPOS, INSTRUMENTOS, MATE-
RIALES Y REACTIVOS QUE INTER-
VIENEN EN LA VALIDACIÓN DEL
PROCESO DE DESPIROGENIZACION.
La Tabla 2 indica los equipos e ins-
trumentos empleados para la valida-
ción del proceso de despirogenización.
Tabla 1. Equipos e instrumentos que intervienen en la calicación de equipos
para la prueba de endotoxinas bacterianas.
DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE
BAÑO DE AGUA MEMMERT WNE 14 L407.0499
HORNO ESTERILIZADOR MEMMERT UNE500 C506.0691
SENSOR DE TEMPERATURA
PT 1000 ------- ------- -------
TERMOMETRO DIGITAL FLUKE 52 II LM200 11050136
CAJA DE CONMUTACION COLE
PARMER ------- 254863
Tabla 2. Equipos e instrumentos que intervienen en la validación del proceso
de despirogenización para la prueba de endotoxinas bacterianas. *Calibrado por
Unimetro.
DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE CALIBRACIÓN
BAÑO DE AGUA MEMMERT WNE 14 L407.0499
Fecha de
Calibración:*
Marzo 2012
Próxima
Calibración:
Marzo 2013
HORNO
ESTERILIZADOR MEMMERT UNE500 C506.0691
Fecha de
Calibración:*
Marzo 2012
Próxima
Calibración:
Marzo 2013
MICROPIPETA 20
– 200 uL.
HTL
LABMATE LM200 846051086
Fecha de
Calibración:*
Abril 2012
Próxima
Calibración:
Abril 2013
Continúa Tabla 2
Ullilen & Iannacone
332
PAIDEIA XXI
MICROPIPETA 20
– 200 uL.
HTL
LABMATE LM200 846051073
Fecha de
Calibración:*
Abril 2012
Próxima
Calibración:
Abril 2013
VORTEX BSM ------- 254863 No aplica
La Tabla 3 indica los equipos calicados empleados para la validación del
proceso de despirogenización.
Tabla 3. Equipos calicados que intervienen en la validación del proceso de
despirogenización para la prueba de endotoxinas bacterianas. **Calicado por
Kossodo.
DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIÓN EMPRESA CALIFICACIÓN
BAÑO DE AGUA 37 ºC Kossodo SAC
Fecha de
Calicación: **
Abril 2012
Próxima
Calicación:
Abril 2013
HORNO
ESTERILIZADOR 250 ºC Kossodo SAC
Fecha de
Calicación: **
Abril 2012
Próxima
Calicación:
Abril 2013
La Tabla 4 indica los materiales y reactivos empleados para la validación del
proceso de despirogenización.
Continúa Tabla 2
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
333
PAIDEIA XXI
EQUIPOS, INSTRUMENTOS, MA-
TERIALES Y REACTIVOS QUE IN-
TERVIENEN EN LA VALIDACION DE
LA PRUEBA DE ENDOTOXINAS BAC-
TERIANAS.
La Tabla 6 indica los equipos e
instrumentos empleados para la
validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
Tabla 4. Materiales y reactivos que intervienen en la validación del proceso de
despirogenización para la prueba de endotoxinas bacterianas. *Proveedor Gen
Lab del Perú.
PRODUCTO LOTE FECHA
DE EXPIRA CARACTERÍSTICAS PROVEEDOR
AGUA REACTIVO
LAL 99732101 Oct. 2013 Contiene: < 0.005
EU/mL Gen Lab*
INDICADOR DE
ENDOTOXINAS DE
10,000 EU
XXX XX XX Gen Lab*
REACTIVO LAL B4711L Oct. 2014 Sensibilidad: 0.03 EU Gen Lab*
TUBOS DE GRADO
LAL 63451D Oct. 2014
Tubos de 10x75 mm.
despirogenizados
envueltos en papel
aluminio sin tapas
Gen Lab*
TIPS GRADO LAL 110921-
201 Oct. 2013 Tips de 100u L. Gen Lab*
Tabla 5. Materiales auxiliares que intervienen en la validación del proceso de
despirogenización para la prueba de endotoxinas bacterianas.
DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIÓN PROCESO
TIJERAS Apirógeno Despirogenización
PINZAS Apirógeno Despirogenización
TUBOS 3x100 Apirógeno Despirogenización
PAPEL ALUMINIO Apirógeno Despirogenización
PIPETAS GRADUADAS
10 mL 5 mL, 2 mL. 1 mL. Apirógeno Despirogenización
MANDIL Estéril Calor húmedo
La Tabla 5 indica los materiales
auxiliares empleados para la validación
del proceso de despirogenización.
Ullilen & Iannacone
334
PAIDEIA XXI
La
Tabla 7 indica los equipos cali-
cados empleados para la validación
La Tabla 8 indica los materiales
y reactivos empleados para la
de la prueba de endotoxinas bacteria-
nas.
validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
Tabla 6. Equipos e instrumentos que intervienen en la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas. *Calibrado por Unimetro.
DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE CALIBRACIÓN
BAÑO DE AGUA MEMMERT WNE 14 L407.0499
Fecha de
Calibración:*
Marzo 2012
Próxima Calibración:
Marzo 2013
HORNO
ESTERILIZADOR MEMMERT UNE500 C506.0691
Fecha de
Calibración: *
Marzo 2012
Próxima Calibración:
Marzo 2013
MICROPIPETA 20 –
200 uL
HTL
LABMATE LM200 846051086
Fecha de
Calibración: *
Abril 2012
Próxima Calibración:
Abril 2013
MICROPIPETA 20 –
200 uL
HTL
LABMATE LM200 846051073
Fecha de
Calibración: *
Abril 2012
Próxima Calibración:
Abril 2013
VORTEX BSM ------- 254863 No aplica
Tabla 7. Equipos calicados que intervienen en la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas. **Calicado por Kossodo.
DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIÓN EMPRESA CALIFICACIÓN
BAÑO DE AGUA 37 ºC Kossodo SAC
Fecha de calicación: **
Abril 2012
Próxima calicación:
Abril 2013
HORNO
ESTERILIZADOR 250 ºC Kossodo SAC
Fecha de calicación: **
Abril 2012
Próxima calicación:
Abril 2013
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
335
PAIDEIA XXI
MUESTRA Y PERSONAL QUE
INTERVIENEN EN LA VALIDACIÓN
DE LA PRUEBA DE ENDOTOXINAS
BACTERIANAS.
La Tabla 10 indica la muestra em-
pleada para la validación de la prueba
de endotoxinas bacterianas.
Tabla 8. Materiales y reactivos que intervienen en la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas. *Proveedor Gen Lab del Perú.
PRODUCTO LOTE
FECHA
DE
EXPIRA
CARACTERÍSTICAS
PROVEEDOR
AGUA REACTIVO LAL 99732101 Oct. 2013 Contiene: < 0.005 EU/
Ml. Gen Lab*
CONCENTRACIÓN
ESTANDAR DE
ENDOTOXINAS
EM83092 Oct. 2013 Concentración: 10 000
UE/vial Gen Lab*
REACTIVO LAL B4711L Oct. 2014 Sensibilidad: 0.03 EU Gen Lab*
TUBOS DE GRADO
LAL 63451D Oct. 2014
Tubos de 10x75 mm
despirogenizados
envueltos en papel
aluminio sin tapas
Gen Lab*
TIPS GRADO LAL 110921-201 Oct. 2013 Tips de 100u L. Gen Lab*
La Tabla 9 indica los materiales au-
xiliares empleados para la validación
de la prueba de endotoxinas bacteria-
nas.
Tabla 9. Materiales auxiliares que intervienen en la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIÓN PROCESO
TIJERAS Apirógeno Despirogenización
PINZAS Apirógeno Despirogenización
TUBOS 3x100 Apirógeno Despirogenización
PAPEL ALUMINIO Apirógeno Despirogenización
PIPETAS GRADUADAS
10 mL 5 mL, 2 mL. 1 mL. Apirógeno Despirogenización
MANDIL Estéril Calor Húmedo
Ullilen & Iannacone
336
PAIDEIA XXI
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
METODOLOGÍA DE LA CALIFICA-
CION DE EQUIPOS.
CALIFICACION DEL HORNO ESTE-
RILIZADOR.
CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN
DEL HORNO ESTERILIZADOR.
En la calicación de instalación se
demostró que el Horno Esterilizador
HE-004 cumple con las especica-
ciones de diseño y ha sido instalada
adecuadamente de acuerdo a las reco-
mendaciones del fabricante. La cali-
cación de instalación trató los siguien-
tes puntos:
Conexiones útiles.
Instalación del equipo.
La Tabla 11 indica el personal que
intervino en la validación de la prueba
Suministro de Energía eléctrica.
Características del Horno Esterili-
zador.
Estructura y función del equipo.
Dispositivos de seguridad.
Limpieza del equipo.
Mantenimiento preventivo.
CALIFICACIÓN DE OPERACIÓN DEL
HORNO ESTERILIZADOR.
La calicación de operación
sirve para demostrar que todos los
componentes y subsistemas que
conforman el Horno Esterilizador
HE-004, operan de manera correcta.
Para llevar a cabo la calicación
de operación se hará empleó del
instructivo I-MIC.07. Uso del Horno
Esterilizador HE-004 y del Manual del
Equipo. La empresa Kossodo realizó
de endotoxinas bacterianas.
Tabla 10. Muestra que interviene en la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
PRODUCTO LOTE Cantidad FECHA
DE EXPIRA
NÚMERO DE
DISPOSITIVOS PARA
LOS ENSAYOS
El Catéter Venoso
Central de 30 cm. 10208042 77 000
unidades Enero - 2017 09 UNIDADES
Tabla 11. Personal que intervino en la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
MATERIALES DESPI-
ROGENIZADOS
EXTRACCIÓN DE
LA MUESTRA
PRUEBA DE SEN-
SIBILIDAD
PRUEBA DE IN-
HIBICION O PO-
TENCIACION
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
PRUEBA DE LÍMITE DE
COAGULACIÓN
PRUEBA DE GEL-
CLOT ROBUSTEZ PRECISION
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
Responsables:
Analista 1
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
337
PAIDEIA XXI
el servicio de calicación haciendo
empleo de un termómetro patrón
digital de código IT-18 de marca
FLUKE 52 II de serie: 11050136, con
0,1 °C de resolución con 10 sensores
tipo “K” de códigos K3-1 al K3-10 que
trabaja conjuntamente con una caja de
conmutación tipo T de código IT-03/K
de marca: Cole Parmer, procedencia
USA. Los sensores fueron distribuidos
de manera uniforme dentro del cuerpo
del Horno Esterilizador HE-004,
siendo colocados cinco por cada nivel
de trabajo. La calicación evaluó el
parámetro de Temperatura, siendo
la especicación establecida por el
usuario de: 250°C ± 5ºC. La calicación
de operación se realizó por 3 ensayos
sin carga. La calicación de operación
trató los siguientes puntos:
Procedimiento Operativo estándar.
Variables a vericar del proceso.
Descripción del Manejo y Uso.
Variables claves del proceso de la
incubadora.
Equipos necesarios para realizar
las pruebas.
Comprobación de los Controles.
Proceso de operación.
Distribución de calor sin carga
Primer Proceso de Operación sin
carga.
Segundo Proceso de Operación sin
carga.
Tercer Proceso de Operación sin
carga.
CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO
DEL HORNO ESTERILIZADOR.
La calicación de desempeño
demostró que el Horno Esterilizador
HE-004 cumple uniformemente a través
del tiempo con las especicaciones
establecidas por el usuario, tanto en
condiciones normales como en las
peores condiciones posibles. Para la
calicación de desempeño se empleó
instructivo I-MIC.07 Uso del Horno
Esterilizador HE-004 y del Manual del
Equipo. La empresa Kossodo realizó
el servicio de calicación haciendo
empleo de un termómetro patrón
digital de código IT-18 de marca
FLUKE 52 II de serie: 11050136, con
0,1 °C de resolución con 10 sensores
tipo “K” de códigos K3-1 al K3-10 que
trabaja conjuntamente con una caja de
conmutación tipo T de código IT-03/K
de marca: Cole Parmer®, procedencia
USA. Los sensores fueron distribuidos
de manera uniforme dentro del cuerpo
del Horno Esterilizador HE-004, siendo
colocados cinco por cada nivel de
trabajo. La calicación de desempeño
evalúa el parámetro de Temperatura,
siendo la especicación establecida
por el usuario de: 250°C ± 5ºC. La
calicación de desempeño se realizó
por 3 ensayos con carga al 100%. La
calicación de desempeño trató los
siguientes puntos:
Variables claves del proceso de
incubación.
Proceso de operación.
Distribución de calor con carga
250°C ± 5°C.
Primer Proceso de Operación con
carga.
Segundo Proceso de Operación con
carga.
Tercer Proceso de Operación con
carga.
Ullilen & Iannacone
338
PAIDEIA XXI
Concluido los ensayos de
calicación, los datos fueron anali-
zados estadísticamente, hallándose
lo siguiente: Tº Promedio A (ºC):
Temperatura promedio en un instante
de tiempo dado. Tº Promedio B (ºC):
Temperatura promedio de un sensor
durante todo el ensayo. Tº Mínima
B (ºC): Temperatura mínima de un
sensor durante todo el ensayo. Tº
Máxima B (ºC): Temperatura máxima
de un sensor durante todo el ensayo.
Criterio de Aceptación: La prueba
se considera correcta si durante los
ensayos la temperatura permanece
dentro de las especicaciones
establecidas por el usuario, caso
contrario se procede a repetir el
ensayo.
CALIFICACION DEL BAÑO DE AGUA.
CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN
DEL BAÑO DE AGUA.
En la calicación de instalación se
demostró que el Baño de Agua BM-
005 cumple con las especicaciones
de diseño y ha sido instalada
adecuadamente de acuerdo a las
recomendaciones del fabricante. La
calicación de instalación trató los
siguientes puntos:
Conexiones útiles.
Instalación del equipo.
Suministro de Energía eléctrica.
Características del Baño de Agua.
Estructura y función del equipo.
Dispositivos de seguridad.
Limpieza del equipo.
Mantenimiento preventivo.
CALIFICACIÓN DE OPERACIÓN DEL
BAÑO DE AGUA.
La calicación de operación
sirve para demostrar que todos los
componentes y subsistemas que
conforman el Baño de Agua BM-005,
operan de manera correcta. Para llevar
a cabo la calicación de operación se
empleó el instructivo I-MIC.09 Manejo
del Baño de Agua BM-005 y del Manual
del Equipo. La empresa Kossodo
realizó el servicio de calicación
haciendo empleo de un termómetro
patrón digital de código IT-18 de marca
FLUKE 52 II de serie: 11050136, con
0,1 °C de resolución con 10 sensores
tipo “K” de códigos K3-1 al K3-10 que
trabaja conjuntamente con una caja de
conmutación tipo T de código IT-03/K
de marca: Cole Parmer®, procedencia
USA. Los sensores fueron distribuidos
de manera uniforme dentro del cuerpo
del Baño de Agua BM-005, siendo
colocados cinco por cada nivel de
trabajo. La calicación de desempeño
evaluó el parámetro de Temperatura,
siendo la especicación establecida
por el usuario de: 37°C ± 1ºC. La
calicación de operación se realizó por
3 ensayos sin carga. La calicación de
operación trató los siguientes puntos:
Procedimiento Operativo estándar.
Variables a vericar del proceso.
Descripción del Manejo y Uso.
Variables claves del proceso de la
incubadora.
Equipos necesarios para realizar
las pruebas.
Comprobación de los Controles.
Proceso de operación.
Distribución de calor sin carga
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
339
PAIDEIA XXI
Primer Proceso de Operación sin
carga.
Segundo Proceso de Operación sin
carga.
Tercer Proceso de Operación sin
carga.
CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO
DEL BAÑO DE AGUA.
La calicación de desempeño
demostró que el Baño de Agua BM-
005 cumple uniformemente a través
del tiempo con las especicaciones
establecidas por el usuario, tanto en
condiciones normales como en las
peores condiciones posibles. Para la
calicación de desempeño se empleó
instructivo I-MIC.09 del Baño de Agua
BM-005 y Manual del Equipo. La
empresa Kossodo realizó el servicio
de calicación haciendo empleo de
un termómetro patrón digital de
código IT-18 de marca FLUKE 52
II de serie: 11050136, con 0,1 °C de
resolución con 10 sensores tipo “K”
de códigos K3-1 al K3-10 que trabaja
conjuntamente con una caja de
conmutación tipo T de código IT-03/K
de marca: Cole Parmer®, procedencia
USA. Los sensores fueron distribuidos
de manera uniforme dentro del cuerpo
del Baño de Agua BM-005, siendo
colocados cinco por cada nivel de
trabajo. La calicación de desempeño
evaluó el parámetro de Temperatura,
siendo la especicación establecida
por el usuario de: 37°C ± 1ºC. La
calicación de desempeño se realizó
por 3 ensayos con carga al 100%. La
calicación de desempeño trató los
siguientes puntos:
Variables claves del proceso de
incubación.
Proceso de operación.
Distribución de calor con carga
Primer Proceso de Operación con
carga
Segundo Proceso de Operación con
carga
Tercer Proceso de Operación con
carga
Concluido los ensayos de calica-
ción, los datos fueron analizados esta-
dísticamente, hallándose lo siguiente:
Tº Promedio A (ºC): Temperatura pro-
medio en un instante de tiempo dado.
Tº Promedio B (ºC): Temperatura pro-
medio de un sensor durante todo el
ensayo. Tº Mínima B (ºC): Temperatu-
ra mínima de un sensor durante todo
el ensayo. Tº Máxima B (ºC): Tempe-
ratura máxima de un sensor durante
todo el ensayo.
Criterio de Aceptación: La prue-
ba se considera correcta si durante
los ensayos la temperatura permanece
dentro de las especicaciones estable-
cidas por el usuario y caso contrario se
procede a repetir el ensayo.
VALIDACIÓN DEL CICLO DE DESPI-
ROGENIZACIÓN POR CALOR SECO
CON EL EMPLEO DE LA PRUEBA DE
ENDOTOXINAS BACTERIANAS-TÉC-
NICA GEL-CLOT
Aplica a los materiales que intervie-
nen en el ciclo de despirogenización en
el horno esterilizador de código interno
HE-004, ubicado en el área de equipos
de Microbiología, para vericar el cum-
Ullilen & Iannacone
340
PAIDEIA XXI
plimiento de las especicaciones.
INDICADOR DE ENDOTOXINA UTI-
LIZADO PARA LA VALIDACION DEL
PROCESO DE DESPIROGENIZA-
CION.
Cada vial contiene aproximada-
mente 10,000 EU (Endotoxin units)
de lipopolisacáridos de E. coli 055:B5,
como certica Charles River Endosafe
luego de haber contrastado con están-
dares de referencia. El vial de indica-
dor, está hecho con Type I Flint glass,
parece vacío, porque la endotoxina
liolizada no ha sido mezclada con
estabilizadores ni otras sustancias de
soporte o llenado. Se recomienda al-
macenar los viales de 2 a 25 oC con
su tapa intacta. Los indicadores de
endotoxina son solo para uso in vitro
y no debe ser usado en humanos ni
animales.
PROCEDIMIENTO DE VALIDACIÓN
DEL PROCESO DE DESPIROGENI-
ZACION.
Exposición de viales: Para la va-
lidación del proceso de despirogeniza-
ción de hornos, se ubicó los indicado-
res de endotoxinas en los puntos más
fríos hallados en la calicación del
horno esterilizador. Inmediatamente
antes de la exposición, se removió la
tapa del vial y se reemplazó con papel
aluminio apirógeno. Posteriormente
se expusieron los viales al proceso de
despirogenización.
Preparación para el análisis: Des-
pués que los indicadores de endoto-
xinas han sido expuestos; los viales
expuestos y los viales sin exposición
(controles positivos) se acondiciona-
ron para su análisis. Los indicadores
fueron ensayados mediante el método
gel-clot. Se rehidrató cada vial (vial
expuesto y no expuesto) con 1 mL de
agua reactivo LAL y se vortexeó por
2 min inicialmente y luego por 1 min
cada 10 min por media h. El análisis
se realizó lo más pronto posible para
una mejor recuperación de la endoto-
xina.
Procedimiento del ensayo por el
método gel-clot: Se vericó la canti-
dad de endotoxina en los viales no ex-
puestos (controles positivos). Se realizó
las diluciones del indicador de endo-
toxina expuesto y no expuesto, 1/10,
1/100, 1/1000, 1/10,000. El núme-
ro de diluciones estuvo en función a
la sensibilidad del lisado a utilizar. Se
realizó la Técnica de LAL en los viales
procesados y no procesados. Se halló
el logaritmo de la cantidad de endoto-
xina del vial procesado y no procesado.
Se restó el logaritmo de endotoxina del
vial procesado del logaritmo de endo-
toxinas del vial no procesado. En caso
de que el resultado del vial procesado y
sus diluciones sean negativos, se con-
sideró, el logaritmo de la sensibilidad
del lisado como la cantidad a sustraer
de la cantidad inicial.
Criterio de aceptación: La
prueba se consideró correcta si el
proceso de despirogenización cuan-
do el ciclo de despirogenización re-
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
341
PAIDEIA XXI
duce por lo menos
1000 UE = (3-log).
VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE EN-
DOTOXINAS BACTERIANAS-MÉTODO
GEL-CLOT
La prueba LAL por el método de gel-
clot, es el método más sencillo, más rá-
pido y más adecuado cuyos resultados
son fáciles de leer, ya que sólo hay po-
sitivos o negativos. El objetivo de éste
trabajo fue determinar su aplicación al
dispositivo médico en el Catéter Venoso
Central de 30 cm, para ello se siguió los
siguientes pasos: Preparación de la solu-
ción madre del estándar de endotoxina y
las soluciones estándar. Preparación de
Reactivo LAL. Prueba de conrmación de
Sensibilidad declarada en la etiqueta del
reactivo LAL. Determinación de la Máxi-
ma Dilución Válida. Prueba de Factores
de interferencia para el método gel-clot.
Pruebas de inhibición y de Potenciación.
Prueba de límite de coagulación. Método
gel-clot.
PROCEDIMIENTO DE VALIDACIÓN DE
LA PRUEBA DE ENDOTOXINAS BAC-
TERIANAS-MÉTODO GEL-CLOT
Preparación de la solución madre
del estándar de endotoxina y las so-
luciones estándar: El reactivo estándar
de endotoxina tiene una potencia de 10
000 unidades de endotoxinas (UE) por
vial. Se reconstituyó todo el contenido
del vial con 5 mL de agua LAL, se mezcló
intermitentemente durante 30 min con
u
n mezclador (vortex) y se usó del vial
para obtener las diluciones en concen-
traciones adecuadas. El tiempo de al-
macenamiento de esta solución madre
no debe exceder los 14 días a tempera-
tura controlada entre 2º - 8ºC para ser
utilizada en preparación de diluciones
posteriores. Antes de usar, se agitó el
vial por 3 min. Cuando se prepararon
las diluciones se agitó por no menos
de 30 seg antes de la siguiente prepa-
ración.
Preparación de Reactivo LAL: Se
reconstituyó el contenido del vial con 5.2
mL de agua LAL, y se dejó en reposo (no
se agitó).
Prueba de conrmación de Sensi-
bilidad declarada en la etiqueta el Re-
activo LAL: Consistió en vericar si el
reactivo LAL tiene la sensibilidad decla-
rada comparándolo con la concentración
estándar de endotoxinas. Se dene como
sensibilidad, a la capacidad del reactivo
para reaccionar con una concentración
de endotoxinas mínima suciente para
dar un resultado positivo. Se expresó
con el símbolo λ (Lambda).
Preparación de la solución de stock
de endotoxinas: Se preparó una serie
de diluciones de la dilución madre del
estándar de endotoxinas en agua LAL
para obtener concentraciones de: 2λ, λ,
0,5λ, 0,25λ (tabla 12) en donde la sensi-
bilidad declarada del reactivo es λ=0,03
UE·mL
-1
.
Ullilen & Iannacone
342
PAIDEIA XXI
Dilución ------- 1 2 3 4 5 6 7 8
ERE (0,03) Vial 300μL A 100μL B 100μL C 100μL B 100μL C 100μL D 100μL E 100μL F
Agua LAL 5 mL 700μL 900μL 900μL 900μL 900μL 900μL 900μL 900μL
Concentracion (EU/mL) 600 60 60,6 (2λ) (λ) (0,5λ) (0,25λ)
SOLUCION B C D
C (SPIKE)
D E F G
Tabla 12. Diluciones para la prueba de sensibilidad declarada del reactivo LAL
de la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
La prueba se realizó por duplicado
sobre cada una de las cuatro
concentraciones estándar incluyendo
los controles negativos. Se mezcló
un volumen de reactivo LAL (0,1
mL) con un volumen igual de una de
las soluciones en cada tubo LAL. Se
colocó en un baño de agua la mezcla
de reacción durante 60±2 min a 37ºC
± 1ºC, evitando vibraciones. Para
analizar la integridad del gel sacar
uno a uno los tubos directamente de
incubación y para la lectura inclinar
suavemente con un ángulo de 30º
hasta invertir suavemente el tubo. Si
se forma un gel rme que permanece
en su lugar después de invertir el
tubo, se registró el resultado como
positivo. Un resultado fue negativo si
no existe formación de gel con esas
características. La prueba no fue
válida a menos que la concentración
más baja de las soluciones estándar
muestre un resultado negativo en
todas las pruebas repetidas. El punto
nal es la última dilución positiva en la
serie de concentraciones decrecientes
de endotoxina que coagula. También se
puede denir como la mayor dilución
que da resultado positivo. El punto
nal estuvo seguido por una dilución
de resultado negativo. Se Calculó
el valor medio de los logaritmos de
la concentración en el punto nal y
luego el antilogaritmo del valor medio
usando la siguiente ecuación:
Media Geométrica de la concentración
del punto nal = Antilog. (∑e / f)
Donde ∑e es la suma de los
logaritmos de las concentraciones
de punto nal en la serie de dilución
utilizada, y f es el número de tubos de
ensayo repetidos. La media geométrica
de la concentración del punto fue
la sensibilidad medida del reactivo
LAL (en UE·mL-1). El rango para la
sensibilidad de un reactivo de 0,03
UE·mL-1 es aceptable, si no es menor
de 0,5 λ y no es mayor de 2 λ, a partir
de ello se conrma la sensibilidad
declarada en la etiqueta y se procede
a utilizar en pruebas realizadas con
este lisado. Es necesario contar con
una concentración de endotoxinas
para llevar a cabo las pruebas de
inhibición y magnicación que nos
conrme la interferencia de la prueba,
ésta solución se conoce como spike. El
spike, es una solución de endotoxinas
que tiene una concentración, en la
cual, cuando se agrega un volumen
menor al 10% del volumen nal de la
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
343
PAIDEIA XXI
muestra, se obtiene una concentración
de 2 λ.
Determinación de la máxima
dilución valida (USP 2012abc):
Se calculó dividiendo el límite de
endotoxinas por la sensibilidad λ
declarada en la etiqueta del reactivo
LAL utilizado (0,03).
MVD = Limite de endotoxina
λ
El límite de endotoxinas permitido
según USP del producto a analizar fue
de 20 UE/ dispositivo. En el líquido
de extracción se calculó el límite de
endotoxinas permitido por la siguiente
formula:
(K x N) / (V)
Donde K es la cantidad de endoto-
xina permitida por equipo, N es el nú-
mero de equipos que se analizan, V es
el volumen total del extracto.
Prueba de Factores de
interferencia para el método gel
– clot - pruebas de inhibición
y de potenciación: Se realizó la
preparación de las soluciones Aa,
Bb, Cc, Dd como se muestra en la
tabla 13 y se procedió a realizar la
prueba de inhibición potenciación
en las soluciones de muestra de una
dilución menor que la MVD que no
contenga endotoxinas detectables
siguiendo el procedimiento indicado
antes en la prueba de conrmación de
sensibilidad declarada en la etiqueta
del reactivo LAL. La media geométrica
de las concentraciones del punto nal
de las soluciones B y C se determinó
la ecuación de esa prueba. Se mezcló
un volumen de reactivo LAL (0,1 mL)
con un volumen igual de una de las
soluciones en cada tubo LAL. Se
colocó en un baño de agua la mezcla
de reacción durante 60 ± 2 min a 37
± 1ºC, evitando vibraciones. Para
analizar la integridad del gel se sacó
uno a uno los Tubos directamente
de incubación y con un único
movimiento suave, y se invirtieron
aproximadamente 180º. Si se forma
un gel rme que permanece en su
lugar después de invertir los tubos, se
registró el resultado como positivo. Un
resultado es negativo si no se forma un
gel con esas características. La media
geométrica de las concentraciones del
punto nal se determinó empleando la
anterior ecuación.
Esta prueba se repitió cuando
cambia cualquier condición que
pueda inuir sobre los resultados de
la misma. La prueba no fue válida a
menos que la solución de muestra de
la preparación en análisis que está
exenta de endotoxinas detectables y
el control negativo de agua reactivo
LAL no muestre ninguna reacción y el
resultado de la prueba de conrmación
de la sensibilidad declarada en la
etiqueta. Si la sensibilidad del lisado
determinada en presencia de la
solución de muestra en el análisis
de las soluciones B de la tabla 13
no es menor de 0,5λ y no es mayor
de 2λ, la solución de la muestra no
contiene factores que intereran en las
condiciones experimentales utilizadas.
Ullilen & Iannacone
344
PAIDEIA XXI
En caso contrario la solución de
muestra que se examinó interere con
la prueba. Si la muestra en análisis no
cumple con la prueba a una dilución
menor que la MVD, se repitió la prueba
empleando una dilución mayor que no
exceda la MVD.
Tabla 13. Diluciones para la prueba de factores de interferencia para el método
gel-clot - Pruebas de inhibición y de potenciación de la validación de la prueba
de endotoxinas bacterianas.
Concentracion de endotoxina/ Factor de Concentracion Numero de
Solucion solucion a la que se agrega Diluyente dilucion inicial de repeticiones
la endotoxina Endotoxina
Aaninguna /solucion de muestra ------ ------ ------ 4
solucion 12λ 4
Bb2 λ /solucion de muestra de 21λ 4
mues tra 40,5λ 4
80,25λ 4
Agua 12λ 2
Cc2 λ /agua para LAL reactivo 21λ 2
para 40,5λ 2
LAL 80,25λ 2
Ddninguna /agua reactivo para LAL ------ ------ ------ 2
De la solución B con respecto a la tabla 13, prepararlo según Tabla 14.
Tabla 14. Diluciones para la preparación de la solución B para la prueba de
factores de interferencia para el método gel-clot - pruebas de inhibición y de
potenciación de la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
SPIKE(10 veces 2λ)
100μL 500μLα 500μL β 500μL γ
(C) 0,6 EU/mL
MVD del producto 900μL 500μL 500μL 500μL
Concentración 0,06 EU/mL 0,03 EU/mL 0,015 EU/mL 0,0075 EU/mL
α (2λ) β (1λ) γ (0,5λ) δ (0,25λ)
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
345
PAIDEIA XXI
Prueba de Límite de Coagulación:
Se preparó las soluciones según la
tabla 15. La solución A y la solución
B de control positivo del producto se
preparó utilizando una dilución no
mayor que la del MVD. Las soluciones
B y C de control positivo contienen la
Se mezcló un volumen de reactivo
LAL (0,1 mL) con un volumen igual de
una de las soluciones en cada tubo LAL.
Se colocó en un baño de agua la mezcla
de reacción durante 60 ± 2 min a 37 ±
1ºC, evitando vibraciones. Para analizar
la integridad del gel se sacó uno a uno
los tubos directamente de incubación
y con un único movimiento suave, se
invirtió aproximadamente 180º. Si se
formó un gel rme que permanece en
su lugar después de invertir los tubos,
se registró el resultado como positivo.
Un resultado fue negativo si no se
formó un gel con esas características.
La prueba no fue válida a menos que
ambas determinaciones repetidas de
las soluciones B y C de control positivo
son positivas y la solución D de control
preparación de la endotoxina estándar
en una concentración que corresponde
al doble de la sensibilidad declarada
en la etiqueta del reactivo LAL. La
solución D de control negativo fue
agua reactiva para LAL.
negativo sea negativa. La preparación
en análisis cumple con la prueba si
se obtienen un resultado negativo en
ambos tubos que contienen la solución
A. Se repitió la prueba cuando se obtuvo
un resultado positivo en un tubo que
contenga solución A y un resultado
negativo en el otro. La preparación de
análisis cumple con la prueba cuando
se obtuvo un resultado negativo en
ambos tubos que contienen la solución
A en el resultado de la repetición.
Método gel-clot: Se preparó las
soluciones A, B, C, y D como se indica
en la tabla 16. Se mezcló un volumen de
reactivo LAL (0,1 mL) con un volumen
igual de una de las soluciones en cada
tubo LAL. Se colocó en un baño de
Tabla 15. Diluciones para la prueba de límite de coagulación de la validación de
la prueba de endotoxinas bacterianas.
Solución Concentración de endotoxina/ Numero de
Solucion a la que se agrega endotoxina Repeticiones
A ninguna/ solucion de muestra diluida 2
B2λ/ solucion de muestra diluida 2
C2λ/Agua reactivo para LAL 2
D ninguna/ Agua reactivo para LAL 2
Ullilen & Iannacone
346
PAIDEIA XXI
agua la mezcla de reacción durante
60 ± 2 min a 37 ± 1ºC, evitando
vibraciones. Para analizar la integridad
del gel se sacó uno a uno los tubos
directamente de incubación y con un
único movimiento suave, se invirtieron
Solución 1: La solución de la
muestra en análisis a la dilución que
no exceda la MVD. Las diluciones
subsiguientes no deben de exceder la
MVD. Se usó agua reactiva para LAL
para hacer series de diluciones de
4 tubos que contenga la solución de
muestras en análisis a concentraciones
de 1, ½, ¼, y ⅛ con respecto a la
dilución usada.
Solución 2: La solución A que
contenga endotoxina estándar a una
concentración de 2λ (control positivo).
aproximadamente 180º. Si se formó
un gel rme que permanece en su
lugar después de invertir los tubos, se
registró el resultado como positivo. Un
resultado fue negativo si no se formó
un gel con esas características.
Solución 3: Dos series de 4 tubos
de agua reactiva LAL que contenga
la endotoxina estándar a una
concentración de 2λ, 1λ, 0,5λ, 0,25λ
respectivamente.
Solución 4: Agua reactivo para LAL
(control negativo).
Para la preparación de los extractos
de la muestra y obtener la solución
para realizar las diluciones proceder
con lo descrito en la tabla 17, según
corresponda:
Para piezas pequeñas: Se realizó
Tabla 16. Diluciones para el método gel-clot para la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Concentracion de endotoxina/ Factor de Concentracion Numero de
Solución solucion a la que se agrega Diluyente dilucion inicial de repeticiones
la endotoxina Endotoxina
1 ninguna /solucion de muestra Agua reactivo 1 ---- 2
para LAL 2 ---- 2
4 ---- 2
8---- 2
22 λ /solucion de muestra --- 1 2λ 2
32λ /Agua reactivo para LAL Agua reactivo 12λ 2
para LAL 21λ 2
40,5λ 2
80,25λ 2
4 ninguna /Agua reactivo para LAL --- --- --- 2
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
347
PAIDEIA XXI
la extracción de 3 muestras en 100
mL de agua de inyección estéril para
extracción y evaluación, se aplicó la
formula descrita anteriormente para
calcular el límite de endotoxinas en el
líquido de extracción, y luego la MVD:
Aspectos éticos: Los autores de-
claran que se cumplió con toda la nor-
matividad ética nacional e internacio-
nal.
RESULTADOS
CALIFICACIÓN DEL HORNO
ESTERILIZADOR
CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN
DEL HORNO ESTERILIZADOR
Instalación. Conexiones útiles: El
horno esterilizador HE-004 se encontró
instalado en el área de equipos del
Área de Microbiología. Temperatura
ambiental: Máximo 25°C. Temperatura
promedio: 21,5°C.
Suministro de energía eléctrica:
Según los requisitos eléctricos
recomendados por el fabricante del
equipo Horno Esterilizador HE-004
20 EU·equipo
-1
x 3 equipo = 0,6 EU·mL
-1
100 mL
MVD = 0,6 EU·mL-1 = 8
0,03 EU·mL-1
(como se indica en la tabla 18), se
comprobó que el horno estuviera
conectado a una fuente de energía
eléctrica y cumpliera con las siguientes
características:
Tabla 18. Requisitos eléctricos reco-
mendados por el fabricante.
Características Conformidad
Fases Monofásico
Conexión a tierra Conforme
Conductores Tipo Aislante
vulcanizado
Protección IP 20
Características del horno
esterilizador: El horno esterilizador,
código interno HE-004, estuvo
conformado por una carcasa exterior
y una cámara interna de trabajo de
acero inoxidable, la cual se caracterizó
por su gran estabilidad, propiedades
higiénicas óptimas y resistencia a la
corrosión. Puerta exterior de acero
inoxidable, el cierre fue hermético
Tabla 17. Diluciones del líquido de extracción para hallar el MVD de la validación
de la prueba de endotoxinas bacterianas.
3 muestras 2mL 2mL a 2mL b 2mL c
Agua LAL 100mL 5mL 4mL 4mL 4mL
Concentracion (EU/mL) 0,24 a 0,12 b 0,06 c 0,03 d
solucion a concentracion de MVD ⅛¼ ½ 1
Ullilen & Iannacone
348
PAIDEIA XXI
para evitar la pérdida de calor. El
calentamiento se efectuó por medio de
las resistencias que se encuentran en
las paredes internas de la cámara, la
irradiación fue por convección natural
del aire. El aire fresco que entra, se
calienta en la cámara de calentamiento
a su vez entra a través de las ranuras
de aire de la pared lateral de la
Características del horno esteri-
lizador.
Manejo de la puerta: La puerta se
abrió tirando del pomo de la puerta.
Se cerró presionando hacia dentro el
pomo de la puerta.
Prendido y apagado del equipo
ON/OFF: Equipo apagado: El mando
giratorio pulsador estuvo encastrado
cámara de interior. La turbina de aire
en la pared posterior de la cámara
interior produjo en comparación con
la convección natural, un cambio
mayor de aire y una mayor circulación
forzada horizontal. La trampilla de
aire en la pared posterior del equipo se
ajustó a la cantidad de aire que entra
y sale (Tabla 19).
dentro del panel y así protegido contra
daños. Equipo prendido: El mando gi-
ratorio pulsador estuvo desencastrado
fuera del panel y se pudo manejar me-
diante el mando giratorio y la tecla set.
Ajustar el cambio de aire: Movien-
do la regleta de aire se abrió y cerró la
trampilla, ajustándose de ésta manera
la cantidad de aire que entra y sale.
Tabla 19. Características del horno esterilizador.
Características Conformidad
Marca MEMMERT
Modelo UNE 500
Nº de serie C506-0691
Código interno HE-004
Temperatura de trabajo 250 ±5 ºC
Alcance de indicación 20 ºC a 300 ºC
Voltaje 230 V/8.7ª
Frecuencia 50/60 Hz
Potencia 2000 watts
Volumen interior 108 L
Anchura de la cámara interior A 560 mm
Altura de la cámara interior B 480 mm
Fondo de la cámara interior C 400 mm
Anchura exterior D 710 mm
Altura exterior E 760 mm
Fondo exterior F 550 mm
Peso 50 Kg
Carga máximo por bandeja 30 Kg
Carga máximo total por estufa 50 Kg
Temperatura ambientales Temperatura entre 5ºC y 40ºC
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
349
PAIDEIA XXI
Ajustar la temperatura: Se man-
tuvo presionada la tecla set y se ajus-
tó con el mando giratorio pulsador, la
temperatura nominal deseada.
Vigilancia electrónica de tempe-
ratura: El rango de ajuste fue hasta
10°C como máximo por encima de la
temperatura máxima de la estufa.
Vigilancia electrónica de tempe-
ratura: El equipo cuenta con un limi-
tador mecánico de temperatura. En el
caso que fallara la unidad de protec-
ción electrónica y que se excediera la
temperatura máxima en unos 20°C,
el limitador de temperatura actuaría
como única medida de protección des-
conectando la calefacción.
Limpieza: Vericación de la lim-
pieza del Horno Esterilizador HE-004
de acuerdo al instructivo I-MIC.07.
Manejo del Horno esterilizador MEM-
MERT HE-004. Vigente hasta agosto
2013.
CALIFICACIÓN DE OPERACIÓN DEL
HORNO ESTERILIZADOR
Procedimiento operativo están-
dar.
Procedimiento de manejo y lim-
pieza del horno esterilizador HE-
004.
Procedimiento : I-MIC.07
Vigencia : Hasta marzo 2013
Variables a vericar del proceso.
Descripción del manejo y uso:
Se encendió el equipo presionando el
mando giratorio permitiendo que éste
salga. Se ajustó el cambio de aire a
condiciones deseadas moviendo la re-
gleta de aire hacia la izquierda para ce-
rrar y hacia la derecha para abrir. Para
la programación de la temperatura, se
mantuvo la tecla SET presionada y se
ajustó con el mando giratorio, girando
hacia la derecha para su aumento y a
la izquierda para su disminución a la
temperatura nominal deseada. Des-
pués de soltar la tecla SET, el equipo
siguió indicando de forma parpadean-
te, durante largo rato, la temperatura
nominal. Después indica la tempera-
tura real del momento, el regulador
comenzó a calentar hasta alcanzar la
temperatura nominal programada. Por
último se cerró la puerta del equipo.
Variables claves del uso del hor-
no esterilizador.
Temperatura. Tiempo. Energía
eléctrica. Condición ambiental.
Equipos necesarios para realizar
las pruebas.
Horno Esterilizador
Equipo : Horno Esterilizador
Vigencia : Hasta marzo 2013
Marca : MEMMERT
Modelo : UNE 500
Localización : Área de Microbiología
Código interno : HE-004
Calibración de los instrumentos
del equipo.
Comprobación de los controles:
Se demostró que los controles del hor-
no esterilizador operan como se es-
pecican. Secuencia de encendido y
apagado. Funcionamiento el switch de
encendido y apagado. Luz indicadora
de calentamiento: Funciona correcta-
Ullilen & Iannacone
350
PAIDEIA XXI
mente la luz indicadora de funciona-
miento de las resistencias.
Control de Temperatura: El con-
trolador permitió alcanzar y mantener
la temperatura programada.
Vericar que el equipo ha sido
calibrado.
Fecha de calibración: 05/03/2012.
Próxima calibración: 04/03/2013.
Proceso de operación.
Distribución de calor sin carga
250°C ± 5°C: Con el horno esteriliza-
dor vacío, se simuló las condiciones
del proceso real de despirogenización,
operando dentro de los parámetros es-
tablecidos.
Especicaciones de operación.
La temperatura alcanzada estuvo
dentro del rango de temperatura pro-
gramada 250°C ± 5°C.
Número de operaciones: 3 opera-
ciones sin carga.
Objetivo: Se realizó una simula-
ción del proceso de incubación sin
carga colocando en cada punto de ca-
libración el sensor de temperatura.
Procedimiento.
Se encendió el equipo Horno Esteri-
lizador HE-004 de acuerdo al instruc-
tivo I-MIC.07 Manejo y limpieza del
horno esterilizador. Con la tecla set
apretada se giró el mando giratorio/
pulsador y seleccionar la temperatura
de 250°C en los casos la prueba lo re-
quiera de acuerdo a la especicación.
De acuerdo a la calibración realizada
al horno esterilizador HE-004, se tomó
como referencia los 10 puntos de cali-
bración, 5 puntos en la parte superior
y 5 puntos en la parte inferior, en los
cuales se colocan los sensores de tem-
peratura en cada punto.
Posiciones de los sensores de Tem-
peratura. Las posiciones 1 y 6 se ubi-
caron sobre el centro de sus respecti-
vos niveles. La posición 2, 3, 4, 5, 7, 8,
9, 10 se ubicaron 9,0 cm de la pared
lateral a 7,0 cm frente al equipo y 7,0
cm de la pared superior. Frecuencia de
toma de datos de los sensores de tem-
peratura. 1 dato de temperatura por
120 seg.
Temperatura de calicación 250°C.
Primer proceso de operación sin
carga.
Prueba de distribución N°1: Se-
guir los pasos de descripción del ma-
nejo y uso. Realizado por la Empresa
Kossodo. Temperatura ambiental:
24,8°C. Humedad ambiental: 42 %.
Hora inicio: 13h 58min. Hora nal:
14h 58min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más
frío correspondió al punto 1. Tempe-
ratura promedio: 250,4°C. Tempera-
tura máxima: 254,7°C. Temperatura
mínimo: 246,5°C. Los resultados de la
temperatura cumplieron con la tempe-
ratura de trabajo que se requiere para
el uso del equipo: 250°C ±5°C.
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
351
PAIDEIA XXI
Segundo proceso de Operación sin
carga.
Prueba de Distribución N° 2: Se
siguió los pasos de descripción del
manejo y uso. Realizado por la Empre-
sa Kossodo. Temperatura ambiental:
24,4°C. Humedad ambiental: 46. Hora
inicio: 14h 00min. Hora nal: 15h
00min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más
frío correspondió al punto 1. Tempe-
ratura promedio: 250,8°C. Tempera-
tura máxima: 254,8°C. Temperatura
mínimo: 246,5°C. Los resultados de la
temperatura cumplieron con la tempe-
ratura de trabajo que se requiere para
el uso del equipo: 250°C ±5°C.
Tercero proceso de Operación sin
carga.
Prueba de Distribución N° 3: Se
siguió los pasos de descripción del
manejo y uso. Realizado por la Em-
presa Kossodo. Temperatura ambien-
tal: 24,8°C. Humedad ambiental: 48
%. Hora inicio: 17h 59min. Hora nal:
18h 59min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 1,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más
frío correspondió al punto 1. Tempe-
ratura promedio: 250,9°C. Tempera-
tura máxima: 254,9°C. Temperatura
mínimo: 246,5°C. Los resultados de la
temperatura cumplieron con la tempe-
ratura de trabajo que se requiere para
el uso del equipo: 250°C±5°C.
CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO
DEL HORNO ESTERILIZADOR
Productos que se colocan en el
horno esterilizador: Despirogeniza-
ción a 250°C. Pipetas, tubos de ensa-
yo, papel aluminio, vaso de precipita-
ción, tijeras y pinzas.
Variables claves del proceso de
Incubación: Temperatura. Condición
ambiental. Tiempo.
Equipos necesarios para realizar
las pruebas.
Equipo: Horno Esterilizador
Marca: MEMMERT
Fecha de calibración: UNE 500
Vigencia de calibración : Área de Mi-
crobiología
Distribución de calor con carga
250°C±5°C: El equipo se cargó con
material descrito a contaminación. 34
tubos de ensayo en paquetes de 4 y 5
unidades. 16 pipetas. 3 vasos de pre-
cipitación de 1 L. Los materiales se en-
volvieron con papel aluminio. Especi-
caciones de operación. La temperatura
alcanzada estuvo dentro del rango de
temperatura programada: 250ºC ±5ºC.
En las pruebas, los sensores de tem-
peratura se colocaron dentro de los
tubos y vasos de precipitación. Núme-
ro de operaciones: 3 operaciones con
carga.
Objetivo: Se determinó la tempe-
ratura de trabajo del equipo en cada
punto de acuerdo al certicado de ca-
libración bajo condiciones reales. Se
siguió los pasos del procedimiento de
Ullilen & Iannacone
352
PAIDEIA XXI
manejo y la ubicación de los sensores
de temperatura para la calicación de
desempeño.
Temperatura de calicación
250°C.
Primer proceso de operación con
carga.
Prueba de penetración N°1: Se
siguió los pasos del Descripción del
Manejo y Uso. Realizado por la Em-
presa Kossodo. Temperatura ambien-
tal: 24,9°C. Humedad ambiental: 45
%. Hora inicio: 10h 56min. Hora nal:
11h 56min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 2,
3, 4, 5, 6, 7, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 1. El punto más
caliente corresponde al punto 8. Tem-
peratura promedio: 250,5°C. Tempe-
ratura máxima: 254,4°C. Temperatura
mínimo: 245,8°C. Los resultados de la
temperatura cumplieron con la tempe-
ratura de trabajo que se requiere para
el uso del equipo: 250°C ±5°C.
Segundo proceso de operación con
carga.
Prueba de penetración N°2: Se
siguió los pasos del Descripción del
Manejo y Uso. Realizado por la Em-
presa Kossodo. Temperatura ambien-
tal: 24,8°C. Humedad ambiental: 49
%. Hora inicio: 17h 04min. Hora nal:
18h 04min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son
1, 2, 3, 7, 8, 9, 10. Los puntos más
fríos correspondieron a los puntos
4 y 5. El punto más caliente corres-
pondió al punto 6. Temperatura pro-
medio: 250,9°C. Temperatura máxi-
ma: 255,0°C. Temperatura mínimo:
245,1°C. Los resultados de la tempe-
ratura cumplieron con la temperatura
de trabajo que se requiere para el uso
del equipo: 250°C ±5°C.
Tercer proceso de operación con
carga.
Prueba de penetración N°3: Se
siguió los pasos de la descripción del
Manejo y Uso. Realizado por la Em-
presa Kossodo. Temperatura ambien-
tal: 24,8°C. Humedad ambiental: 49
%. Hora inicio: 10h 22min. Hora nal:
11h 26min
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 1,
2, 3, 5, 6, 7, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 4. El punto más
caliente correspondió al punto 8. Tem-
peratura promedio: 250,9°C. Tempe-
ratura máxima: 254,9°C. Temperatura
mínimo: 245,1°C. Los resultados de la
temperatura cumplieron con la tempe-
ratura de trabajo que se requiere para
el uso del equipo: 250°C ±5°C.
CALIFICACIÓN DEL BAÑO DE AGUA
CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN
DEL BAÑO DE AGUA
Conexiones útiles.
Instalación: El Baño de Agua BM-
005 se encontró instalado en el área
de Recuento Microbiano – LAL de Mi-
crobiología. Temperatura ambiental:
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
353
PAIDEIA XXI
Máximo 25°C. Temperatura promedio:
21,5°C.
Suministro de energía eléctrica:
Según los requisitos eléctricos reco-
mendados por el fabricante del equipo
baño de agua BM-005 (como se indi-
ca en la tabla 20), se comprobó que el
horno estuviera conectado a una fuen-
te de energía eléctrica y cumpliera con
las siguientes características:
Tabla 20. Requisitos eléctricos reco-
mendados por el fabricante.
Características Conformidad
Fases Monofásico
Conexión a tierra Conforme
Conductores Tipo Aislante
vulcanizado
Protección IP 20
Características del baño de agua.
El baño de agua, código interno
BM-005, estuvo conformada por una
carcasa exterior y una cámara inter-
na de trabajo de acero inoxidable, la
cual se caracteriza por su gran estabi-
lidad, propiedades higiénicas óptimas
y resistencia a la corrosión. Puerta
exterior de acero inoxidable, el cierre
fue hermético para evitar la pérdida de
calor. El calentamiento se efectuó por
medio de las resistencias que se en-
cuentran en las paredes internas de la
cámara, la irradiación fue por convec-
ción natural del aire. El aire fresco que
entró, se calienta en la cámara de ca-
lentamiento a su vez entra a través de
las ranuras de aire de la pared lateral
de la cámara de interior. La turbina de
aire en la pared posterior de la cámara
interior produjo en comparación con la
convección natural, un cambio mayor
de aire y una mayor circulación forza-
da horizontal. La trampilla de aire en
la pared posterior del equipo se ajustó
a la cantidad de aire que entra y sale.
Ullilen & Iannacone
354
PAIDEIA XXI
Características del baño de agua.
Manejo de la puerta: La puerta se
abrió tirando del pomo de la puerta.
Se cerró presionando hacia dentro el
pomo de la puerta.
Prendido y apagado del equipo
ON/OFF: Equipo apagado: El mando
giratorio pulsador estuvo encastrado
dentro del panel y así protegido contra
daños. Equipo prendido: El mando gi-
ratorio pulsador estuvo desencastrado
fuera del panel y se manejó mediante el
mando giratorio y la tecla set.
Selección de parámetros: Girando
el mando giratorio/pulsador, se selec-
cionó un parámetro. El parámetro se-
leccionado parpadea con luz clara de
manera que pudiera ajustarse, con la
tecla set apretada por medio del man-
do giratorio y pulsador.
Ajustar la temperatura: Se giró el
mando giratorio/pulsador hasta que
parpadea el símbolo °C. La tempera-
tura teórica puede ajustarse con tecla
set accionada. Seguidamente muestra
la temperatura que se asignó de for-
ma parpadeante. Después se indicó
la temperatura real del momento y el
regulador empezó a calentar hasta al-
canzar la temperatura teórica.
Dispositivos de seguridad: Pre-
sentó un limitador de temperatura
mecánico, termostato de seguridad
Tabla 21. Características del baño de agua.
Características Conformidad
Marca MEMMERT
Modelo WNE14
Nº de serie L407.0499
Código interno BM-005
Temperatura de trabajo 37 +/-1 ºC
Alcance de indicación 10 ºC a 95 ºC
Voltaje 230 V
Frecuencia 50/60 Hz
Potencia 1800 watts
Volumen interior 14 L
Anchura de la cámara interior A 350 mm.
Altura de la cámara interior B 290 mm.
Fondo de la cámara interior C 140 mm.
Anchura exterior D 578 mm.
Altura exterior E 436 mm.
Fondo exterior F 337 mm.
Peso 16 Kg
Carga máximo por bandeja 30 Kg
Carga máximo total por estufa 50 Kg
Temperatura ambientales Temperatura entre 5ºC y 40ºC
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
355
PAIDEIA XXI
mecánico limitador de temperatura,
si durante el funcionamiento falló la
unidad de regulación electrónica y se
sobrepasó en aproximadamente 30 °C
la temperatura máxima preajustada
desde fábrica, como última medida de
seguridad, el limitador de temperatura
se desconectó de manera permanente
el calentador.
Protección de marcha en seco:
El limitador de temperatura mecánico
junto a la función de protección contra
sobre "temperatura" tiene la función
de protección contra marcha en seco,
es decir, la calefacción se desconectó
de modo permanente si se desciende
por debajo de un determinado nivel de
líquido.
Limpieza: Vericación de la limpie-
za del Baño de Agua BM-005 de acuer-
do al instructivo I-MIC.09. Manejo y
del Baño de Agua BM-005 vigente has-
ta agosto 2013.
CALIFICACIÓN DE OPERACIÓN DEL
BAÑO DE AGUA
Procedimiento operativo estándar.
Procedimiento de manejo y limpieza
del baño de agua BM-005
Procedimiento : I-MIC.09
Vigencia : Hasta marzo 2013
Variables a vericar del proceso.
Descripción del manejo y uso:
Para encender el equipo se presionó el
mando giratorio permitiendo que éste
salga. Para la programación de la tem-
peratura se rotó el botón del mando
giratorio hasta que el símbolo de °C se
muestre, se mantuvo la tecla SET pre-
sionada y se ajustó con el mando gi-
ratorio, girando hacia la derecha para
su aumento y a la izquierda para su
disminución a la temperatura nomi-
nal deseada. Después de soltar la tecla
SET, el equipo siguió indicando de for-
ma parpadeante, durante largo rato, la
temperatura nominal. Después indica
la temperatura real del momento y el
regulador comenzó a calentar hasta
alcanzar la temperatura nominal pro-
gramada. Por último se cerró la puerta
del equipo.
Variables claves del uso del hor-
no esterilizador: Temperatura. Tiem-
po. Energía eléctrica. Condición am-
biental.
Equipos necesarios para realizar
las pruebas.
Equipo : Baño de Agua
Vigencia : Hasta marzo 2013
Marca : MEMMERT
Modelo : WNE 14
Localización : Área de Microbiología
Código interno : BM-005
Calibración de los instrumentos del
equipo.
Comprobación de los controles:
Se demostró que los controles del
baño de agua operan como se espe-
cican. Mando giratorio/pulsador de
encendido y apagado. Funcionamiento
del mando giratorio pulsador para el
encendido y apagado. Luz indicadora
de calentamiento. Funcionamiento co-
Ullilen & Iannacone
356
PAIDEIA XXI
rrecto de la luz indicadora de funcio-
namiento de las resistencias.
Control de temperatura: El con-
trolador permitió alcanzar y mantener
la temperatura programada. Se veri-
có que el equipo ha sido calibrado.
Fecha de calibración: 05/03/2012.
Próxima calibración : 04/03/2013
Proceso de operación.
Distribución de calor sin carga:
Con el baño de agua vacío, se simuló
las condiciones del proceso real de in-
cubación, operando dentro de los pa-
rámetros establecidos.
Especicaciones de operación.
La temperatura alcanzada estuvo
dentro del rango de temperatura pro-
gramada 37°C ±1°C. Número de opera-
ciones: 3 operaciones sin carga.
Objetivo: Se realizó una simula-
ción del proceso de incubación sin
carga colocando en cada punto de ca-
libración el sensor de temperatura.
Procedimiento: Se encendió el
equipo de acuerdo al instructivo
I-MIC.09 Se manejó del baño de
agua. Con la tecla set apretada se
giró el mando giratorio/pulsador y
se seleccionó la temperatura de 37°C
en los casos la prueba lo requiera de
acuerdo a la especicación. De acuerdo
a la calibración realizada al baño de
agua BM-005, se tomó como referencia
los 10 puntos de calibración, 5 puntos
en la parte superior y 5 puntos en
la parte inferior, en los cuales se
colocaron los sensores de temperatura
en cada punto.
Posiciones de los sensores de
Temperatura: Las posiciones 1 y 6 se
ubicaron sobre el centro de sus res-
pectivos niveles. La posición 2, 3, 4, 5,
7, 8, 9, 10 se ubicaron 3,0 cm de la pa-
red lateral a 4,0 cm frente al equipo y
2,0 cm de la pared superior. Frecuen-
cia de toma de datos de los sensores
de temperatura. 1 dato de temperatu-
ra por 120 seg.
Temperatura de calicación 37°C.
Primer proceso de operación sin carga.
Prueba de distribución N°1: Se
siguió los pasos del descripción del
manejo y uso. Realizado por la Empresa
Kossodo. Temperatura ambiental:
24,8°C. Humedad ambiental: 42 %.
Hora inicio: 08h 06min. Hora nal:
09h 36min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 1,
2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 5. Temperatura
promedio: 37,2°C. Temperatura máxi-
ma: 37,6°C. Temperatura mínimo:
36,9°C. Los resultados de la tempera-
tura cumplieron con la temperatura de
trabajo que se requiere para el uso del
equipo: 37°C ±1°C.
Segundo proceso de operación sin
carga.
Prueba de distribución N° 2: Se
siguió los pasos de descripción del
manejo y uso. Realizado por la Empresa
Kossodo. Temperatura ambiental:
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
357
PAIDEIA XXI
24,8°C. Humedad ambiental: 49 %.
Hora inicio: 11h 05min. Hora nal:
12h 35min
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 1,
2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 5. Temperatura
promedio: 37,2°C. Temperatura máxi-
ma: 37,7°C. Temperatura mínimo:
36,8°C. Los resultados de la tempera-
tura cumplieron con la temperatura de
trabajo que se requiere para el uso del
equipo: 37°C ±1°C.
Tercero proceso de operación sin
carga.
Prueba de distribución N° 3: Se
siguió los pasos de descripción del
manejo y uso. Realizado por la Em-
presa Kossodo. Temperatura ambien-
tal: 24,8°C. Humedad ambiental: 48
%. Hora inicio: 10h 16min. Hora nal:
11h 46min
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 1,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 2. Temperatura
promedio: 37,3°C. Temperatura máxi-
ma: 37,6°C. Temperatura mínimo:
37,0°C. Los resultados de la tempera-
tura cumplieron con la temperatura de
trabajo que se requiere para el uso del
equipo: 37°C ±1°C.
CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO
DEL BAÑO DE AGUA
Productos que se colocan en el
baño de agua: Tubos que contienen
agua LAL, Pyrotell, Concentración es-
tándar de endotoxinas, agua de inyec-
ción estéril y la extracción de la mues-
tra. Gradillas.
Variables claves del proceso de
incubación: Temperatura. Condición
ambiental. Tiempo.
Equipos y materiales necesarios
para realizar las pruebas.
Equipos.
Equipo : horno esteri-
lizador
Marca : MEMMERT
Fecha de calibración : UNE 500
Materiales: Tubos LAL, gradilla y
agua de inyección estéril.
Proceso de operación.
Distribución de calor con carga:
El equipo se cargó con material des-
crito a continuación. 12 tubos LAL en
una gradilla.
Especicaciones de operación.
La temperatura alcanzada estuvieron
dentro del rango de temperatura pro-
gramada: 37ºC ±1ºC. En las pruebas,
los sensores de temperatura se coloca-
ron dentro de los tubos LAL.
Ullilen & Iannacone
358
PAIDEIA XXI
Número de operaciones: 3 opera-
ciones con carga.
Objetivo: Se determinó la tempe-
ratura de trabajo del equipo en cada
punto de acuerdo al certicado de cali-
bración bajo condiciones reales. Se si-
guió los pasos del punto según el pro-
cedimiento de manejo y la ubicación
de los sensores de temperatura para la
calicación de desempeño.
Temperatura de calicación
37°C.
Primer proceso de operación con
carga.
Prueba de penetración N°1: Se si-
guió los pasos de descripción del ma-
nejo y uso. Realizado por la Empresa
Kossodo.
Temperatura ambiental: 24,8°C.
Humedad ambiental: 42 %. Hora ini-
cio: 09h 04min. Hora nal: 10h 34min
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más frío
correspondió al punto 1. Temperatura
promedio: 37,3°C. Temperatura máxi-
ma: 37,7°C. Temperatura mínimo:
37,0ºC. Los resultados de la tempera-
tura cumplieron con la temperatura de
trabajo que se requiere para el uso del
equipo: 37°C ±1°C.
Segundo proceso de operación con
carga.
Prueba
de penetración N°2: Se si-
guió los pasos de descripción del manejo
y uso. Realizado por la Empresa Kosso-
do.
Tempe
ratura ambiental: 24,8°C.
Humedad ambiental: 49 %. Hora ini-
cio: 13h 16min. Hora nal: 14h 46min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son 2,
3, 6, 7, 8, 9, 10. El punto más frío co-
rrespondió al punto 5. Los puntos más
calientes correspondieron a los puntos
1 y 4. Temperatura promedio: 37,4°C.
Temperatura máxima: 38,0°C. Tempe-
ratura mínimo: 36,9ºC. Los resultados
de la temperatura cumplieron con la
temperatura de trabajo que se requie-
re para el uso del equipo: 37°C ±1°C.
Tercer proceso de operación con
carga.
Prueba de penetración N°3: Se
siguió los pasos de descripción del
manejo y uso. Realizado por la Empresa
Kossodo.
Temperatura ambiental: 24,8°C.
Humedad ambiental: 49 %. Hora ini-
cio: 09h 21min. Hora nal: 10h 51min.
Conclusión: Los puntos que pre-
sentaron temperatura uniforme son
1, 3, 5, 7, 8, 9. Los puntos más ca-
lientes corresponden a los puntos 2,
6, 10. El punto más caliente corres-
pondió al punto 4. Temperatura pro-
medio: 37,4°C. Temperatura máxima:
38,0°C. Temperatura mínimo: 36,9ºC.
Los resultados de la temperatura cum-
plieron con la temperatura de trabajo
que se requiere para el uso del equipo:
37°C ±1°C.
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
359
PAIDEIA XXI
DESARROLLO DEL PROCESO DE
DESPIROGENIZACIÓN
DETERMINACIÓN DE LA CONCEN-
TRACIÓN DE ENDOTOXINAS POR
EL MÉTODO DE LAL Y DE LA RE-
DUCCION LOGARÍTMICA OBTENIDA
CÁLCULOS.
Punto nal del vial control positivo:
Log de 10,000 EU = 4
Punto nal del vial expuesto: Log de
0,03EU = - 1,522
Sustracción:
Reducción Logarítmica: log
10,000EU/mL - log 0,03EU
= 4 - (-1,522)
= 5,522
= 5,522 = > 3 Logaritmos
EN EL CICLO DE DESPIROGENIZA-
CIÓN.
La Tabla 22 indica el primer ensayo
de exposición de viales de indicadores
de endotoxinas para validar el proceso
de despirogenización.
El ciclo de Despirogenización reduce
más de 3 logaritmos cumpliendo con
la especicación indicada.
Resultado: Conforme.
La Tabla 23 indica el segundo ensayo
de exposición de viales de indicadores
de endotoxinas para validar el proceso
de despirogenización.
Tabla 22. Primer ensayo de exposición de viales de indicadores de endotoxinas
para validar el proceso de despirogenización.
DILUCIONES 1/10 1/100 1/1000 1/10 000
Punto Nº1 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº4 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº5 (-) (-) (-) (-)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control negativo (agua LAL) (-) (-)
Ullilen & Iannacone
360
PAIDEIA XXI
CÁLCULOS.
Punto nal del vial control positivo:
Log de 10,000 EU = 4
Punto nal del vial expuesto: Log de
0,03EU = - 1,522
Sustracción:
Reducción Logarítmica: log
10,000EU/mL - log 0,03EU
= 4 - (-1,522)
= 5,522
= 5,522 = > 3 Logaritmos
El ciclo de despirogenización reduce
más de 3 logaritmos cumpliendo con
la especicación indicada.
Resultado: Conforme.
La Tabla 24 indica el tercer ensayo
de exposición de viales de indicadores
de endotoxinas para validar el proceso
de despirogenización.
Tabla 23. Segundo ensayo de exposición de viales de indicadores de endotoxinas
para validar el proceso de despirogenización.
DILUCIONES 1/10 1/100 1/1000 1/10 000
Punto Nº1 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº4 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº5 (-) (-) (-) (-)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control negativo (agua LAL) (-) (-)
Tabla 24. Tercer ensayo de exposición de viales de indicadores de endotoxinas
para validar el proceso de despirogenización.
DILUCIONES 1/10 1/100 1/1000 1/10 000
Punto Nº1 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº4 (-) (-) (-) (-)
Punto Nº5 (-) (-) (-) (-)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control positivo (+) (+) (+) (+)
Control negativo (Agua LAL) (-) (-)
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
361
PAIDEIA XXI
CÁLCULOS.
Punto nal del vial control positivo:
Log de 10,000 EU = 4
Punto nal del vial expuesto: Log de
0,03EU = - 1,522
Sustracción:
Reducción Logarítmica: log
10,000EU/mL - log 0,03EU
= 4 - (-1,522)
= 5,522
= 5,522 = > 3 Logaritmos
La Tabla 26 indica el segundo
ensayo de conrmación de sensibilidad
declarada en etiqueta del reactivo LAL
El ciclo de Despirogenización reduce
más de 3 logaritmos cumpliendo con
la especicación indicada.
Resultado: Conforme.
DESARROLLO DE LA PRUEBA
DE ENDOTOXINAS–MÉTODO GEL-
CLOT.
PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE
SENSIBILIDAD DECLARADA EN LA
ETIQUETA EL REACTIVO LAL.
La Tabla 25 indica el primer ensayo
de conrmación de sensibilidad decla-
rada en etiqueta del reactivo LAL para
la validación de la prueba de endotoxi-
nas bacterianas.
para la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Tabla 25. Primer ensayo de conrmación de sensibilidad declarada en etiqueta
del reactivo LAL para la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBOS
CONCENTRACIÓN ESTANDAR DE
ENDOTOXINAS
AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ Control
(-) Control (-)
1(+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(+) (+) (-) (-) (-) (-)
4(+) (+) (-) (-) (-) (-)
Ullilen & Iannacone
362
PAIDEIA XXI
La Tabla 27 indica el tercer ensayo
de conrmación de sensibilidad
declarada en etiqueta del reactivo LAL
para la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Tabla 27. Tercer ensayo de conrmación de sensibilidad declarada en etiqueta
del reactivo LAL para la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBOS
CONCENTRACIÓN ESTANDAR DE
ENDOTOXINAS AGUA LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ Control (-) Control (-)
1(+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(+) (+) (-) (-) (-) (-)
4(+) (+) (-) (-) (-) (-)
Tabla 26. Segundo ensayo de conrmación de sensibilidad declarada
en etiqueta del reactivo LAL para la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
ENSAYO
TUBOS
CONCENTRACIÓN ESTANDAR DE
ENDOTOXINAS AGUA LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ Control (-) Control (-)
1(+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(+) (+) (-) (-) (-) (-)
4(+) (+) (-) (-) (-) (-)
La Tabla 28 indica el cálculo de la
media geométrica (GM) para conrmar
la sensibilidad declara en etiqueta del
reactivo LAL para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 28. Cálculo de la media geométrica (GM) para conrmar la sensibilidad
declara en etiqueta del reactivo LAL para la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
TUBO ENDOPOINT LOGARITMO PROMEDIO ANTILOGARIT-
MO
10,03 -1,5228787
X= -6,09
4
Antilogaritmo -
1,5228787
20,03 -1,5228787
30,03 -1,5228787
40,03 -1,5228787
Σ= -6,091515 = -1,52 = 0,03
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
363
PAIDEIA XXI
GM = antilog log (sensibilidad)
Número de repeticiones
= antilog(log 0,03 + log 0,03 + log 0,03 + log 0,03)
4
= antilog(-6,091515) = 0,03 UE/mL
4
Conclusión
: Se cumple que 2 λ es
mayor que λ= 0,03 UE/mL y menor que 0,5
λ. Se conrma la sensibilidad declarada en
la etiqueta del reactivo LAL.
PRUEBA DE FACTORES DE IN-
TERFERENCIA PARA EL MÉTODO
GEL-CLOT. PRUEBA DE INHIBICIÓN
Y DE POTENCIACIÓN.
La Tabla 29 indica el primer ensayo
de inhibición y potenciación para la
validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
Tabla 29. Primer ensayo de inhibición y potenciación para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Aa Bb Cc Dd
ENSAYO
TUBOS
SOLU-
CIÓN
DE LA
MUES-
TRA
CSE EN SOLUCIÓN
DE LA MUESTRA(EU/
mL)
CSE EN AGUA LAL
(EU/mL)
AGUA
LAL
AGUA
DE IN-
YECCIÓN
ESTERIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ
Con-
trol
(-)
Control
(-)
1(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
La Tabla 30 indica el segundo ensayo de inhibición y potenciación para la
validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 30. Segundo ensayo de inhibición y potenciación para la validación de
la prueba de endotoxinas bacterianas.
Aa Bb Cc Dd
ENSAYO
TUBOS
SOLU-
CIÓN
DE LA
MUES-
TRA
CSE EN SO-
LUCIÓN DE LA
MUESTRA(EU/mL)
CSE EN AGUA LAL
(EU/mL)
AGUA
LAL
AGUA DE
INYEC-
CIÓN ES-
TERIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ Con-
trol (-) Control (-)
1(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
Ullilen & Iannacone
364
PAIDEIA XXI
La Tabla 31 indica el tercer ensayo de inhibición y potenciación para la
validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 31. Tercer ensayo de inhibición y potenciación para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Aa Bb Cc Dd
ENSAYO
TUBOS
SOLU-
CIÓN
DE LA
MUES-
TRA
CSE EN SOLUCIÓN
DE LA MUESTRA(EU/
mL)
CSE EN AGUA LAL
(EU/mL)
AGUA
LAL
AGUA DE
INYEC-
CIÓN ES-
TERIL
2λ 1λ 0,5λ 0,25λ 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ Control
(-) Control (-)
1(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
Conclusión: Se cumple que la solución
A de la muestra y el control negativo D no
muestra reacción (no se forma gel). En la
solución B de la muestra se cumple que la
reacción no es menor de 0,5λ y no mayor
de 2λ. En la solución C de la muestra se
cumple que la reacción no es menor de
0,5λ y no mayor de 2λ. Finalmente se
concluye que la solución de la muestra
no contiene factores que intereren en las
condiciones del ensayo.
PRUEBA DE LÍMITE DE COAGULACIÓN:
La Tabla 32 indica el primer ensayo de
límite de coagulación para la validación de
la prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 32. Primer ensayo de límite de coagulación para la validación de la prueba
de endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBO
CSE EN SOLUCIÓN DE
LA MUESTRA(EU/mL)
CSE EN AGUA LAL Y AGUA DE
INYECCIÓN ESTÉRIL (EU/mL)
A B C D D
SOLUCIÓN
DE LA
MUESTRA
2λ 2λ AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTERIL
1(-) (+) (+) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
La Tabla 33 indica el segundo ensayo de límite de coagulación para la
validación de la prueba de endotoxinas bacterianas.
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
365
PAIDEIA XXI
Tabla 33. Segundo ensayo de límite de coagulación para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBO
CSE EN SOLUCIÓN DE
LA MUESTRA(EU/mL)
CSE EN AGUA LAL Y AGUA DE
INYECCIÓN ESTÉRIL (EU/mL)
A B C D D
SOLUCIÓN
DE LA
MUESTRA
2λ 2λ AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTERIL
1(-) (+) (+) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
La Tabla 34 indica el tercer ensayo de límite de coagulación para la validación
de la prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 34. Tercer ensayo de límite de coagulación para la validación de la prueba
de endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBO
CSE EN SOLUCIÓN DE
LA MUESTRA(EU/mL)
CSE EN AGUA LAL Y AGUA DE
INYECCIÓN ESTÉRIL (EU/mL)
A B C D D
SOLUCIÓN DE
LA MUESTRA 2λ 2λ AGUA LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTERIL
1(-) (+) (+) (-) (-)
2(-) (+) (+) (-) (-)
3(-) (+) (+) (-) (-)
4(-) (+) (+) (-) (-)
Conclusión: Se cumple que las dos
repeticiones de las soluciones B y C
muestran reacción (formación de gel).
En ambas repeticiones en la solución
D de control negativo del Agua LAL, no
muestra reacción (no se forma gel). En
la solución A, ambas repeticiones de
la solución de la muestra no muestra
reacción (no se forma gel). La muestra
cumple con la prueba a una dilución
que no exceda el MVD. Finalmente
según los resultados obtenidos se
conrma el límite de coagulación.
ENSAYO GEL-CLOT:
Especicación: Las diluciones
repetidas de la solución 4 de control
negativo son negativas; las diluciones
repetidas de solución 2 de control
positivo del producto son positivas.
Resultados: CONFORME. La
Ullilen & Iannacone
366
PAIDEIA XXI
solución 4 de control negativo deben
ser negativas ambas repeticiones. La
solución 2 de control positivo, deben
ser positivas ambas repeticiones.
La Tabla 35 indica el primer ensayo
de gel-clot para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 35. Primer ensayo de gel-clot para la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
ENSAYO
TUBO
SOLUCIÓN 1 SOLUCIÓN 2 SOLUCIÓN 3 SOLUCIÓN 4
FACTOR DE
DILUCIÓN DE LA
MUESTRA
SOLUCIÓN
DE LA
MUESTRA
CONCENTRACIÓN
ESTANDAR DE
ENDOTOXINA EN AGUA
LAL
AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
8 4 2 1 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ
1(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
La Tabla 36 indica el segundo ensayo de gel-clot para la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Tabla 36. Segundo ensayo de gel-clot para la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
ENSAYO
TUBO
SOLUCIÓN 1 SOLUCIÓN 2 SOLUCIÓN 3 SOLUCIÓN 4
FACTOR DE
DILUCIÓN DE LA
MUESTRA SOLUCIÓN DE
LA MUESTRA
CONCENTRACIÓN
ESTANDAR DE ENDOTOXINA
EN AGUA LAL AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
8 4 2 1 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ
1(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
La Tabla 37 indica el tercer ensayo de gel-clot para la validación de la prueba
de endotoxinas bacterianas.
Tabla 37. Tercer ensayo de gel-clot para la validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
ENSAYO
TUBO
SOLUCIÓN 1 SOLUCIÓN 2 SOLUCIÓN 3 SOLUCIÓN 4
FACTOR DE DILUCIÓN
DE LA MUESTRA SOLUCIÓN
DE
LA MUESTRA
CONCENTRACIÓN
ESTANDAR DE
ENDOTOXINA EN AGUA LAL AGUA
LAL
AGUA DE
INYECCIÓN
ESTÉRIL
8 4 2 1 2λ 1λ 0,5λ 0,25λ
1(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
2(-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
Conclusión: Se cumple que las dos
repeticiones de las soluciones B y C
muestran reacción (formación de gel).
En ambas repeticiones en la solución
D de control negativo del Agua LAL, no
muestra reacción (no se forma gel). En
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
367
PAIDEIA XXI
la solución A, ambas repeticiones de
la solución de la muestra no muestra
reacción (no se forma gel). La muestra
cumple con la prueba a una dilución
que no exceda el M.V.D. Finalmente
según los resultados obtenidos se
conrma el límite de coagulación
CONTROL MICROBIOLÓGICO EN
EL ÁREA DE RECUENTO MICROBIA-
NO-LAL:
CONTROL MICROBIOLÓGICO AM-
BIENTAL
Especicación: Grado C: Máximo
50 UFC/Placa.
Método: Exposición por placas.
Primer ensayo: La Tabla 38 indica
el primer control microbiológico am-
biental de los ensayos correspondien-
tes a la validación de la prueba de en-
dotoxinas bacterianas.
Tabla 38. Primer control microbiológico ambiental de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas.
ZONA UBICACIÓN BACTERIAS
( UFC/P/H)
HONGOS
( UFC/P/H)
ENSAYO
REALIZADO
Área LAL
Próximo al sistema
de inyección de aire < 1 < 1
Validación de
BET
Próximo al sistema
de extracción de aire < 1 < 1
Próximo a la mesa de
trabajo < 1 < 1
Esclusa de persona
Ingreso al área LAL 3 < 1
Resultado: Conforme según la especicación.
Segundo ensayo: La Tabla 39 indica el segundo control microbiológico
ambiental de los ensayos correspondientes a la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Tabla 39. Segundo control microbiológico ambiental de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas.
ZONA UBICACIÓN BACTERIAS
( UFC/P/H)
HONGOS
( UFC/P/H)
ENSAYO
REALIZADO
Área LAL
Próximo al sistema
de inyección de aire < 1 < 1
Validación de
BET
Próximo al sistema
de extracción de aire < 1 < 1
Próximo a la mesa de
trabajo < 1 < 1
Esclusa de persona
Ingreso al área LAL 2 < 1
Ullilen & Iannacone
368
PAIDEIA XXI
Resultado: Conforme según la
especicación.
Tercer ensayo: La Tabla 40 indica el
tercer control microbiológico ambiental
de los ensayos correspondientes a la
validación de la prueba de endotoxinas
bacterianas.
Tabla 40. Tercer control microbiológico ambiental de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas.
ZONA UBICACIÓN BACTERIAS
( UFC/P/H)
HONGOS
( UFC/P/H)
ENSAYO
REALIZADO
Área LAL
Próximo al sistema
de inyección de
aire
< 1 < 1
Validación de
BET
Próximo al sistema
de extracción de
aire
< 1 < 1
Próximo a la mesa
de trabajo < 1 < 1
Esclusa de
persona Ingreso al
área LAL
2 < 1
Resultado: Conforme según la especicación
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE
SUPERFICIE DE EQUIPOS E INSTA-
LACIONES:
Especicaciones: Equipos ≤ 5
UFC/ 25cm² y Piso ≤ 10 UFC / 25cm²
Método: Hisopado de supercie.
Primer ensayo: La Tabla 41 indica
el primer control microbiológico
de supercie de los ensayos
correspondientes a la validación de la
prueba de endotoxinas bacterianas.
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
369
PAIDEIA XXI
Tabla 41. Primer control microbiológico de supercie de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas. UFC = Unidades formadoras de colonias.
ÁREA UBICACIÓN BACTERIAS
(UFC/25 cm²)
HONGOS
(UFC/25 cm²)
ENSAYO
REALIZADO
Recuento
Microbiano
Mesa de trabajo 2 <1
Validación
de
BET
Baño de agua 2 <1
Vortex 2 <1
Piso <1 <1
Resultado: Conforme según la especicación
Segundo ensayo: La Tabla 42 indica el segundo control microbiológico
de supercie de los ensayos correspondientes a la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Tabla 42. Segundo control microbiológico de supercie de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas. UFC = Unidades formadoras de colonias.
ÁREA UBICACIÓN BACTERIAS
(UFC/25 cm²)
HONGOS
(UFC/25 cm²)
ENSAYO
REALIZADO
Recuento
Microbiano
Mesa de
trabajo <1 <1
Validación de
BET
Baño de agua 2 <1
Vortex 2 <1
Piso 2 <1
Resultado: Conforme según la especicación.
Ullilen & Iannacone
370
PAIDEIA XXI
Tercer ensayo: La Tabla 43 indica el tercer control microbiológico de
supercie de los ensayos correspondientes a la validación de la prueba de
endotoxinas bacterianas.
Tabla 43. Tercer control microbiológico de supercie de los ensayos
correspondientes a la validación de la prueba de endotoxinas bacterianas. BET
= Prueba de endotoxinas bacterianas. UFC = Unidades formadoras de colonias.
ÁREA UBICACIÓN BACTERIAS
(UFC/25 cm²)
HONGOS
(UFC/25 cm²)
ENSAYO
REALIZADO
Recuento
Microbiano
Mesa de
trabajo 1 <1
Validación de
BET
Baño de agua 1<1
Vortex 1 <1
Piso 3 <1
Resultado: Conforme según la especicación
DISCUSIÓN
Con respecto a la calicación de los
equipos, los resultados obtenidos en la
calicación del horno esterilizador, los
ensayos demuestran que la tempera-
tura no se distribuye de manera uni-
forme en toda la cámara del horno, lo
cual requiere mayor tiempo de calen-
tamiento para alcanzar la temperatu-
ra establecida, considerados como los
puntos fríos. Tal comportamiento se
debe a que la resistencia del horno se
encuentra en la parte inferior, además
el sistema de recirculación de aire pro-
voca un retardo en la homogenización
de la temperatura en la cámara por el
mecanismo de transferencia de calor
por convección. Este comportamiento
y uctuaciones de temperatura entre
los ensayos en el horno esterilizador es
similar a los resultados hallados por
Perdomo & Montero (2003).
Con relación a la validación del pro-
ceso despirogenización, según Dawson
(1993), y Perdomo & Montero (2003),
en los ensayos los aspectos más dis-
cutidos han sido la recuperación de la
endotoxina, posiblemente por las ca-
racterísticas del recipiente, el método
para la extracción y el uso de indicado-
res comerciales sin exactitud en la po-
tencia de la endotoxina (WHO, 2011).
En los ensayos realizados en el pre-
sente trabajo, se usó un Indicador de
endotoxina el cual se adquirió en Gen
Lab® y tiene la garantía de Charles Ri-
ver cuya potencia se especíca en su
certicado de análisis.
De acuerdo a la Validación de BET
(prueba de endotoxinas bacterianas)
(Wheeler, 2017), se conrma la sensi-
bilidad del etiquetado del reactivo LAL
en las diferentes concentraciones de
endotoxina: 2λ, λ, 0,5λ, 0,25λ, en don-
de la sensibilidad declarada del reacti-
vo es 0,03 UE·mL-1. En la recuperación
Test of bacterial endotoxins (gel–clot)
371
PAIDEIA XXI
se obtuvo 10 000 UE en el in
dicador
no expuesto, demostrando la potencia
de la endotoxina contenida en cada in-
dicador. Los ensayos conrman que el
ciclo de despirogenización reduce más
de 3 logaritmos y por ende cumple con la
especicación mencionada en la litera-
tura. Se vericó mediante los resultados
estadísticos donde la media geométrica
obtenida de los logaritmos de la última
concentración es donde se presentó la
formación del gel, estuvo dentro del ran-
go permitido entre 0,5 λ y 2 λ, a partir
de ello se conrma la sensibilidad decla-
rada en la etiqueta. Según los datos es-
tadísticos los dos ensayos cumplen con
los parámetros establecidos en la USP
(Solís, 2004) y USP (2012abc).
Solís (2004) en sus resultados esta-
blece la evidencia que el producto eva-
luado no inhibe ni magnica la reacción
de endotoxinas. Se vericó en los ensa-
yos, que la detección de endotoxinas no
se ve afectado por el dispositivo médico
Catéter Venoso Central de 30 cm, para
lo cual se realizó las pruebas de la sen-
sibilidad del reactivo en el producto, en
agua LAL y agua de inyección estéril,
para conrmar y comparar que la detec-
ción de endotoxinas no fue afectada por
el producto (Osorio et al., 2007; Sharma
et al., 2011).
La información obtenida a través de la
prueba de Límite de coagulación mues-
tra que el dispositivo médico Extraux
30cm, no contiene una concentración de
endotoxinas mayor al límite de endotoxi-
nas especicado según USP 20 UE/dis-
positivo, el cual se basa en la formación
de gel en la presencia de endotoxinas en
una concentración mayor a la sensibili-
dad del reactivo LAL. El resultado cum-
ple con el parámetro establecido por la
ICH (2010) y USP (2012abc).
De acuerdo a los resultados de los
ensayos gel-clot, se determinó que las
concentraciones de la muestra del dis-
positivo médico Catéter Venoso Central
de 30 cm no presenta formación de gel,
además las concentraciones de agua LAL
y la Concentración Estándar de Endoto-
xina, forman gel en las concentraciones
λ y 2 λ. Se conrma el cumplimiento de
lo establecido por la ICH (2010), USP
(2012) y Sharma et al., (2011).
Se realizó la validación de la técnica
analítica para la prueba BET-método
gel-clot en el catéter venoso central de
30 cm. Se calicaron los equipos: hor-
no esterilizador HE-004 y baño de agua
BM-001 que intervienen en la prueba de
BET-método gel-clot en el catéter venoso
central de 30 cm. Se validó el proceso de
despirogenización del horno esterilizador
en los materiales que se emplean para
la BET- método gel-clot en el catéter ve-
noso central de 30 cm. Se realizó la va-
lidación del método gel-clot en el catéter
venoso central de 30 cm. Se estableció
mediante los resultados obtenidos que la
BET - método gel-clot en el catéter ve-
noso central de 30 cm cumple con los
parámetros establecidos.
Ullilen & Iannacone
372
PAIDEIA XXI
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Received October 8, 2018.
Accepted December 28, 2018.