RESUMEN

Introduccion: Myrciaria dubia conocido como “camu camu” es una fruta que crece en la Amazonía y tiene como principal característica su alto contenido de vitamina C o ácido ascórbico, el cual tiene el rol de protección en la espermatogénesis por ser un compuesto con excelente acción reductora. El proposito de esta investigacion fue evaluar la capacidad citoprotectora in vivo del extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh “camu-camu” frente al daño mutagénico producido por el antineoplásico ciclofosfamida (CP) sobre la línea germinal masculina.
Metodología: Se utilizaron ratones (n= 60) divididos en cinco grupos tratamiento: T1= control negativo (sin tratamientos); T2 ingirió el extracto acuoso (10mgkg-1), T3 ingirió el extracto acuoso (50mgkg-1), T4 ingirió el extracto acuoso (100mgkg-1); T5 es el control positivo (se le administró solamente CP). A todos se inyectaron una dosis única de CP (50 mgkg-1) vía intraperitoneal., El tratamiento con camu-camu continúo por 45 días, luego los ratones fueron eutanizados para determinar la calidad espermática y la frecuencia del daño al ADN mediante el protocolo de índice de fragmentación de ADN espermático – protocolo Halomax.
Resultados: Se observó en todos los ensayos el efecto del extracto de camu-camu (p< 0,05) respecto al control. El grupo T4, el cual se administró la mayor concentración del extracto acuoso del fruto (100 mgkg-1), evidenció el mayor efecto citoprotector del camu-camu (p< 0,05).
Conclusión: El efecto dañino al ADN por la acción oxidativa del CP podría estar siendo inhibido o modulado por el extracto acuoso del fruto de “camu camu”.

Palabras clave: camu-camu, Myrciaria dubia, ciclofosfamida, fragmentación del ADN, ratón, semen. (fuente: DeCS-BIREME)


ABSTRACT

Introduction: Myrciaria dubia known as “camu camu” is a fruit that grows in the Amazon and its main characteristic is its high content of vitamin C. Ascorbic acid has a protective role in spermatogenesis as it is a compound that has excellent reducing action. The purpose of this research was to evaluate in vivo the cytoprotective capacity of the aqueous extract of the fruit of Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh “camu-camu” against the mutagenic damage produced by the antineoplastic drug cyclophosphamide (CP) on the male germ line.
Methodology: Mice (n= 60) were divided into five treatment groups: T1= negative control (without treatment); T2 ingested the aqueous extract (10mgkg-1), T3 ingested the aqueous extract (50mgkg-1), T4 ingested the aqueous extract (100mgkg-1); T5 is the positive control. All of them were injected with a single dose of CP (50 mgkg-1) intraperitoneally. Treatment with camu-camu continued for 45 days, then the mice were euthanized to determine sperm quality and the frequency of DNA damage using the Index protocol. Sperm DNA fragmentation – Halomax protocol.
Results: The effect of camu-camu extract was observed in all trials (p< 0.05) compared to the negative control. Group T4, which was administered the highest concentration of the aqueous extract of the fruit, evidenced the cytoprotective effect of camu-camu (p< 0.05).
Conclusion: The damaging effect on DNA due to the oxidative action of CP could be inhibited by the aqueous extract of the “camu camu” fruit.

Keywords: Camu-camu, Myrciaria dubia, Cyclophosphamide, DNA fragmentation, mouse, semen. (source: MeSH NLM)

INTRODUCCIÓN

La infertilidad es definida por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad del sistema reproductivo entendida como la incapacidad de lograr un embarazo clínico después de 12 meses o más de relaciones sexuales sin el empleo del algún método anticonceptivo⁽¹⁾. E Esta condición afecta a casi un 20% de las parejas en edad reproductiva y se considera que el factor masculino contribuye con el 50% de los casos. El primer análisis que se hace un varón que acude a un centro de reproducción asistida para poder predecir su potencial fértil es el espermatograma que en resumen consiste en el análisis macroscópico y microscópico del fluido seminal. Adicionalmente hoy en día se están tomando en cuenta nuevas pruebas complementarias que evalúan otros aspectos de los espermatozoides como por ejemplo la integridad de su material genético⁽²⁾.

La importancia del análisis del ADN del espermatozoide radica en que diversos estudios han demostrado que la integridad del ADN en el espermatozoide afectaría los resultados clínicos en los tratamientos de reproducción asistida y que a pesar de los datos que brinda el espermatograma para evaluar la calidad espermática, aproximadamente un 10% a 15% de los varones diagnosticados con infertilidad presentan parámetros del espermatograma dentro de rangos normales aunque podrían presentar defectos en el ADN de los espermatozoides. La rotura de la hebra de ADN en los espermatozoides se atribuye a diversos motivos dentro de los cuales se encuentran la producción excesiva de radicales libres en el eyaculado, así como la exposición a factores ambientales, ocupacionales, y hábitos tóxicos⁽³⁾. Un alto daño del ADN espermático se ha correlacionado a infertilidad, desarrollo embrionario defectuoso, falla en la implantación y un incremento de abortos recurrentes⁽⁴⁾.

Ciclofosfamida (CP) [N, N-bis (2-cloroetil) tetrahidro-2H-1, 3,2 oxaza - fosforin-2-amino 2-oxido] es un agente alquilante comúnmente utilizado como fármaco antineoplásico e inmunosupresor. La citotoxicidad de la CP es mediada por la alquilación del ADN en la posición N7 de guanina y la formación de cross-links del tipo ADN-ADN y ADN-proteína, así como quiebres en una de las hebras del ADN^(5-7). La ciclofosfamida produce infertilidad al interrumpir la meiosis antes de la etapa de paquiteno produciendo así daño genotóxico en la línea germinal y deterioro en las células de Leydig^(8-10). Las células eucariotas para mantener la estabilidad genética detienen su ciclo celular, lo cual, permite la activación de mecanismos de reparación del ADN⁽¹¹⁾, pero cuando el daño es severo se activan vías de muerte celular tal como la apoptosis⁽¹²⁾. La apoptosis describe un patrón morfológico único de muerte celular caracterizado por condensación de la cromatina, formación de rupturas en la membrana, y la fragmentación del ADN; este mecanismo, juega un papel importante en la homeostasis de organismos multicelulares. La función anormal de apoptosis se ha asociado a varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cánceres.

“Camu camu” (Myrciaria dubia) es una fruta que crece en la Amazonía y tiene como principal característica su alto contenido de vitamina C o ácido ascórbico⁽¹³⁾. Se ha reportado que el ácido ascórbico tiene rol de protección en la espermatogénesis al ser un compuesto que tiene excelente acción reductora, en consecuencia se convierte en un buen antioxidante^(14-16). Hay reportes en los cuales se comprobó mediante el ensayo in vivo de micronúcleos en médula ósea de ratón, que el extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia H. B. K. Mc Vaugh “camu camu”, posee un efecto antimutagénico contra el daño producido por sales con fluor y que cuando se suministra anticipadamente tiene un efecto citoprotector en la misma linea celular⁽¹⁷⁾. Otro trabajo hecho en nuestro laboratorio comprobo el efecto protector de camu-camu de 3 líneas celulares tratadas previamente in vivo con bromato de potasio⁽¹⁸⁾. Basados en la evidencia científica reportada se plantea como objetivo del presente trabajo de investigación, determinar si el “camu camu” puede revertir el efecto negativo de la CP sobre la línea germinal masculina en ratones, enfocando esta evaluación en el índice de fragmentación del ADN de los espermatozoides, los resultados logrados podrían ser extrapolados para su uso en humanos y de esa manera restablecer la fertilidad en pacientes que hallan requerido el uso de esta droga en su tratamiento contra el cáncer.

El test Halomax es una técnica empleada para identificar y evaluar los espermatozoides que presentan daño en su ADN. Es decir, permite identificar aquellos espermatozoides que tienen su material genético (ADN) dañado y así diferenciarlos de los que no lo tienen. Este test permite establecer la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado en el total de muestra analizada. Se estima que, utilizando métodos de reproducción normales, un porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado superior al 30 % reduce o en algunos casos elimina la posibilidad de conseguir en embarazo a término.

El propósito de esta investigacion fue evaluar in vivo la capacidad citoprotectora del extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh “camu-camu” frente al daño mutagénico producido por el antineoplásico ciclofosfamida (CP) sobre la línea germinal masculina en ratones.

MÉTODOS

DISEÑO Y ÁREA DE ESTUDIO

Estudio preclínico experimental en el área de biología experimental.

POBLACIÓN Y MUESTRA.

La muestra estuvo conformada por 60 ratones machos (Mus musculus) de la cepa albina BALB/c (entre 6 y 8 semanas de edad) obtenidos del bioterio del Instituto Nacional de Salud, en Lima-Perú. A los grupos tratamiento de dosis de camu camu, se les administró el extracto acuoso mediante sonda nasogástrica N°18 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Los ratones fueron mantenidos a condiciones estándar de bioterio: fotoperiodo de 14 horas (h) luz y 10h oscuridad, temperatura de 25°-27° C, humedad relativa: 90%, acceso libre a una dieta con pellets (Bedoce, Perú) y agua ad libitum. Los ratones luego de un periodo de aclimatación en el bioterio de la Facultad, fueron distribuidos aleatoriamente en jaulas, en cinco grupos de tratamiento (n=12). El día de inicio del estudio, se les administró CP (50 mgKg^-1) por única vez vía intraperitoneal, excepto al grupo control negativo.

VARIABLES DE ESTUDIO

En el presente trabajo se evaluaron los pesos de órganos reproductivos, los espermatogramas, análisis de la motilidad, análisis de la vitalidad, análisis de la morfología espermática, recuento espermático preciso, integridad de la membrana plasmática y la evaluación del Índice de Fragmentación de ADN espermático.

PROCEDIMIENTOS:

Plantas

Frutos de “camu-camu”, Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh fueron colectados en la ciudad de Pucallpa en Perú; transportados vía aérea a Lima y trasladado inmediatamente al laboratorio de Reproducción y Biología del Desarrollo de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Las plantas fueron certificadas por el Departamento de Botánica de la UNMSM. En el laboratorio, el fruto fue pesado y licuado; la pulpa de los frutos de “camu-camu” fue extraído y secado a 60º C por 24 horas en una estufa de convección de aire seco.

Posteriormente, se preparó un extracto acuoso al 10% (p/v) por 24 horas a 60º C. Después de las 24 horas el extracto fue decantado, filtrado, cuantificado y guardado a -20 °C; con este extracto se preparó otro extracto acuoso final al 2% (p/v). El fruto de “camu camu” fue liofilizado y almacenado para su posterior uso. La distribución del liofilizado de “camu camu” fue resuspendido en agua destilada como vehículo, en tres dosis diferentes (10 mgKg-1,50 mgKg-1 y 100 mgKg-1). Se administró el “camu camu” vía sonda nasogástrica de Fisher n° 18 diariamente durante 45 días.

Diseño experimental

Los ratones separados en jaulas tuvieron la siguiente distribución; un grupo control negativo CN (n=12) que se administró vía ip solución salina durante el mismo periodo de tiempo; un grupo T2 (n=12) el cual se le administró extracto de camu – camu (10 mgkg-1 de PC) por 45 días; un grupo T3 (n=12) el cual se le administró extracto de camu – camu (50 mgkg-1 de PC) por 45 días; un grupo T4 (n=12) el cual se le administró extracto de camu – camu (100 mgkg-1 de PC) por 45 días; un grupo T5 (Control positivo), el cual se le administró via ip Sólo ciclofosfamida (50 mgKg-1 PC) por única vez.

Durante el transcurso de los tratamientos se obtendrán los pesos corporales diariamente y al finalizar todos los especímenes de cada grupo fueron sometidos a dos evaluaciones. La primera es la evaluación de espermatogramas y la segunda es la evaluación del Índice de Fragmentación del ADN espermático.

Finalizados los tratamientos los ratones fueron eutanizados y diseccionados para separar los órganos reproductivos, aislarlos de los cuerpos grasos y colocarlos en suero fisiológico a 37° C para realizar los espermatogramas respectivos acorde con los parámetros aprobados por la OMS⁽¹⁹⁾, en donde se incluye el Análisis de la motilidad, análisis de la vitalidad, análisis de la morfología espermática, recuento espermático preciso, integridad de la membrana plasmática y la evaluación del Índice de Fragmentación de ADN espermático.

Obtención de órganos reproductivos.

Con ayuda del estereoscopio se separaron los siguientes órganos del sistema reproductivo masculino (del lado derecho e izquierdo): testículo, cabeza y cuerpo del epidídimo, cola del epidídimo y conducto deferente, a continuación, fueron pesados y mantenidos en suero fisiológico a 37° C durante la aplicación del protocolo para espermatogramas. Se tomó la cola del epidídimo para seccionarlo en 0.5 de Buffer fosfato salino (PBS) a 37° C. para el análisis de la fragmentación del ADN espermático tal cual indica el protocolo del Kit Halomax (HALOTECH DNA SL). Se considera espermatozoides con ADN fragmentado aquellos con un halo grande y con manchas de dispersión de la cromatina y espermatozoides sin ADN fragmentado aquellos con un pequeño y compacto halo de dispersión de la cromatina.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Los resultados fueron tabulados adecuadamente e ingresados en el software Excel 2007 para ser procesados en el paquete estadístico SPSS versión 17.0 para Windows. Los resultados serán mostrados como media ± desviación estándar (DE) y contrastados mediante ANOVA utilizando el test de Levene (para evaluar homogeneidad de varianzas), test de Kolmogorov-Smirnov (distribución normal de los pesos y concentración espermática) y el test de Tukey y de Bonferroni para datos paramétricos (morfología, vitalidad e integridad espermática) con niveles de significancia p<0.05 y p<0.01.

Aspectos éticos

El cuidado y manejo de los animales se realizó de acuerdo con las pautas éticas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio⁽²⁰⁾.

RESULTADOS

No se observaron diferencias significativas en el incremento del peso corporal, peso de los testículos, epidídimos y próstata (p>0,05) (Tabla I); así como, en la morfología del espermatozoide (no se incluye en las tablas), entre los grupos analizados durante el experimento. Asimismo, los resultados de la vitalidad, motilidad, integridad de la membrana y el conteo espermático, se detallan en la Tabla II.

Las diferencias citológicas entre espermatozoides fragmentados y no fragmentados se muestran en la Fig. 1 y 2. En la Fig. 1, que representa al grupo control positivo (solo ciclosfosfamida, 50 mgKg-1 PC) se observan halos grandes, evidencia de daño al ADN del espermatozoide de ratón en un valor superior a los de la Fig. 2, donde se ven espermatozoides del grupo 4 (solo ciclofosfamida, 50 mgkg-1 de PC) + extracto de camu camu (100 mgkg-1 de PC), donde se ven escasos espermatozoides con halo grande. Hay que destacar que la presencia de flagelo diferencia los espermios de otras posibles células involucradas.

DISCUSIÓN

La reproducción y la fertilidad son la base de la continuidad de las especies. Sin embargo, cuando nos referimos a nuestra propia especie esta premisa va más allá de simplemente cumplir nuestro fin biológico, puesto que, si bien es cierto, la infertilidad como enfermedad no ocasiona la muerte de los individuos, sí ocasiona por lo general situaciones que podrían establecerse como carentes de bienestar psicológico y social⁽¹⁾. Visto desde esta óptica, todo esfuerzo en generar conocimientos que permitan ayudar a las personas en el objetivo de lograr la concepción deberían ser consideradas prioritarias desde el punto de vista biológico y clínico.

El efecto protector de las sustancias antioxidantes contra la genotoxicidad puede realizarse de tres maneras disminuyendo la asimilación de genotoxicantes prooxidantes, previniendo su formación en la dieta misma; como agente reductor en los lugares de acción de los pro oxidante, induciendo enzimas de detoxicación capaces de reducir a los intermediarios activos de oxígeno^(3-16).

Al analizar el efecto protector del extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia mediante el test de integridad del ADN espermático se evidenció que no existen diferencias significativas entre CN y los grupos tratamiento; estos resultado sugiere un efecto protector del extracto acuoso del fruto del camu-camu frente al daño oxidativo de CP. Por otra parte, se determinó que el suplemento oral con vitamina C en humanos disminuye el daño al DNA inducido por el peróxido de hidrogeno (H2O2). Estudios in vivo en células humanas e in vivo en roedores demostraron que altas concentraciones intracelulares de ácido ascórbico reducen las mutaciones causadas por el estrés oxidativo del KBrO3(20); es probable que el alto contenido de Acido Ascórbico (vitamina C) presente en el fruto de “camu-camu”, sea la responsable del efecto protector evidenciado en los resultados al encontrarse un número similar de células de grado 0 entre T1 y T4.

Es conocido que el CP induce alteraciones permanentes a partir de diferentes tipos de daños que pueden ser detectados en un test de micronúcleo mediante el bloqueo de citocinesis ^{(22, 23)}. Estos hallazgos indicarían que el CP induce a un daño del DNA por una serie de diferentes mecanismos además del estrés oxidativo.

CONCLUSIÓN

Se concluye que la administración oral de extracto acuoso de “camu camu” podría contrarrestar, modular y neutralizar los efectos del CP, evidenciado esto en la disminución de la tasa de espermios con daño en el ADN nuclear en las muestras tratadas.

LIMITACIONES DEL ESTUDIO

Las limitaciones del estudio fueron de naturaleza logística en la institución donde se desarrolló el trabajo; principalmente de índole de suspensiones de actividades no planificadas durante los fines de semana (a veces desde el viernes) que perjudico la dosificación y la continuidad del seguimiento de los animales. Además, la imposibilidad de ingreso los días domingo al pabellón de investigación por falta de personal de vigilancia. Todo esto ocasiono retrasos y repetición del diseño experimental.

http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_serial&pid=2223-2516&lng=en&nrm=iso

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